本生烟乙醇酸氧化酶GOX的结构与功能研究

发布时间：2020-04-06 19:15

【摘要】：由于植物细胞在进行光合作用的过程中.同时发生着光呼吸,导致净光合速率会下降25%-50%。乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GOX)作为光呼吸途径的关键酶之一,定位于过氧化物酶体中,以黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)为辅因子催化乙醇酸氧化为乙醛酸。在人体内,GOX可以催化乙醇酸和乙醛酸生成草酸,而草酸是肾结石的主要成分,因此近年来GOX被作为一个治疗肾结石和原发性高草酸尿综合征的有效靶点。目前,人们已在酶学等方面对GOX有了一定了解,并解析了一些含FMN的GOX晶体结构,但是,尚无不含辅因子FMN的GOX结构的报道,人们对于GOX如何行使其催化功能的分子机制、FMN如何结合到活性中心的过程等并不清楚。为了解决上述问题,本论文结合结构生物学以及生物化学与分子生物学等方法对此进行了深入研究。本论文通过原核表达并在纯化过程中尝试多种缓冲液后,获得了含有辅因子FMN的本生烟GOX蛋白(Holo-GOX)和不含辅因子FMN的本生烟GOX蛋白(Apo-GOX),采用蒸汽扩散法成功获得并优化了 Holo-GOX和Apo-GOX的蛋白晶体,进而解析了它们的晶体结构。通过中性缓冲液纯化的GOX含有FMN,具有很强的酶活力;而通过弱碱性缓冲液纯化的GOX不含FMN,基本丧失了酶活力。本论文首次获得了 Apo-GOX的晶体结构,通过分析比较Holo-GOX和Apo-GOX的结构发现,它们都是由8个排列在内侧的β折叠片层和8股环绕在外侧的α螺旋组成的(β/α)8桶型结构。在Holo-GOX中.FMN位于桶型结构β折叠组的羧基端,通过氢键与GOX相结合,loop6、loop4和αB-αC之间的loop形成“盖子”盖在桶型结构β折叠组羧基端的开口处,阻止FMN解离。在Apo-GOX中,loop6和αB-αC之间的loop向外侧溶液方向摆动,将开口打开,同时loop4上的αD消失,整体柔性也变得更大,“盖子”变为开启状态,FMN从GOX上解离,活性中心口袋的电荷也随着结构发生了变化。Holo-GOX和Apo-GOX在晶体结构和溶液中都以四聚体形式存在,但Apo-GOX的聚集状态更为松散。在对Apo-GOX各亚基互作界面的分子间作用力进行分析后发现,一些在Holo-GOX亚基之间形成的盐键和氢键网络,特别是组成“盖子”的3个loop中的氨基酸残基部分,在Apo-GOX中随着结构的变化而消失。本论文首次发现一个存在于分子间界面的pH传感器(sensor),当缓冲液从中性变为弱碱性时,pH传感器内的分子间作用力减弱甚至被破坏,导致盖子结构由“关闭”变为“打开”状态,从而释放FMN。在这个过程中,四聚体中的每个亚基轻微旋转,桶型结构β折叠组羧基端开口处的互作面积减少,同时GOX羧基末端“尾巴”处的αG与相邻GOX的α6形成新的结合表面。在与同源性较差的人GOX的结构进行比对后发现,该分子间pH传感器同样存在。本论文通过解析Holo-GOX和Apo-GOX的晶体结构,为深入研究GOX的催化作用机制提供了结构依据,为通过调节pH来改变GOX的酶活性从而控制光呼吸途径提供了新思路,为以GOX为靶点的肾结石和原发性高草酸尿综合征的治疗提供了新的方向。
【图文】：

羧基端,六肽,本生,融合蛋白

为了探宄ＧＯＸ的ＰＴＳ是否存在于其羧基端，Ｖｏｌｏｋｉｔａ等构建了羧基端截短的Ｐ－葡逡逑萄糖醛缩酶（ＧＵＳ）和本生烟ＧＯＸ的羧基端六肽组成的融合蛋白，并通过转基因植物逡逑研宄ＧＯＸ的转运，结果发现约５０％的融合蛋白被定位到了过氧化物酶体中（图１－２），逡逑因此推测ＧＯＸ羧基端的六肽中含有ＰＴＳ序列（Ｖｏｌｏｋｉｔ＾邋１９９１）。逡逑但是，也有证据表明ＧＯＸ的ＰＴＳ并不只存在于其羧基端。１９９５年Ｈｏｍｇ等利用体逡逑外运送系统来研究ＧＯＸ向乙醛酸循环体转运的情况时发现，，该转运是一个依赖于温逡逑度并需要ＡＴＰ的过程，他们设计了邋３个突变蛋白并观察其转运情况，发现缺失氨基端逡逑５９个氨基酸残基和羧基端５３个氨基酸残基的截短片段蛋白均能进行转运，而用羧基逡逑端２０个氨基酸残基与二氢叶酸还原酶连接的融合蛋白却不能进行正常的转运。因此他逡逑们认为：不管羧基端的氨基酸序列所起的作用如何，可能还存在其它的ＰＴＳ序列逡逑（Ｈｏｍｇ邋ｅｔ邋ａｌ．５１９９５；邋Ｌｏｐｅｚ－Ｈｕｅｒｔａｓ邋ｅｔ邋ａｌ．５１９９９）0逡逑４逡逑

光呼吸,过氧化物酶体,甘油酸,植物叶片

转化为丝氨酸，同时释放Ｃ0２，这是光呼吸的产物；之后丝氨酸又可转回过氧化物酶逡逑体中转变为羟基丙酮酸，经氧化生成甘油酸；甘油酸从过氧化物酶体返回叶绿体后会逡逑转化为磷酸甘油酸（图１－３）。逡逑ＣＡＬＶＩＮ逦Ｒｉｂｕｔｏｓｅ邋１．５邋？逡逑ＣＹＣＬＥ逦ｂｉ５ｐｈｏｓｐｌＴＱｔ９＾＞ｕ２逡逑？＊Ｈｙ１逦—＇——＊邋Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ逦人逡逑ｒ－，＿逦ｇｔ＾ｅｒａｔｅ０＇阡0々＿仙逡逑Ｈ－Ｊ邋Ｐａｌａｔｅ逦ＡＯＰ－￣Ｌ邋ｐ逡逑ＡＴＰ—ｒ－＾１逦ｉ逡逑Ｇｌｙｃｅｒａｔｅ逦Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ逡逑－ｇ—ＯｘａｌＤＱｃｅｉａｔｅ逦＾＾逦ＣＨＬＯＲＯＰＬＡＳＴ邋，逡逑ｒ逦逦逦一N逡逑Ｉ逦．．逦．逦．逦Ｇｌｙｃｅｒａｔｅ逦２ＧＪｙｃｏｔａｔｅ逦ｉ逡逑■逦ＮＡＤ＜－￣－邋逦邋逦＾－0２逦逦逡逑｜［ｍｄｈ１逦W〔邋W邋ｐ逡逑ＯｘＳ＾ＮＡＤＨ－＾逦＾Ｈ２0２邋—？邋Ｈ２０逡逑Ｉ邋ａｃｅｔａｔｅ逦备逦＋１／２0２逦腿逡逑Ｉ逦Ｈｙｄｒｏｘｙｐｙａｉｖａｔｅ邋２Ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ逦｜逡逑ｓ逦＼＼邋＾Ｇｌｕｔａｍａｔｅ邋＾：—逡逑Ｉ逦［Ｓ＾］邋Ｘ＂邋＞邋［Ｇ＾ｆ］逦＇逡逑｜逦／逦＾、＞２－0ｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ逡逑＾ＰＥＲＯＸＩＳＯＭＥ邋Ｓｅ｜ｉｎｅ逦２ＧｌＪｃｉｎｅ逦Ｊ逡逑（逦０逦Ｃ0２逦０逦＾逡逑Ｉ逦ＮＨ３邋Ｉ逡逑Ｓｅｒｉｎｅ邋＊—２Ｇｌｙｃｉｎｅ逡逑—（＿１逦？邋Ｏｘａｉｏａｃｅｔａｔｅ＾．逦＊逦、逡逑丫逦逦ＮＡＯＨ邋ＮＡＤ逡逑＾ｙ￣ＭａｌＱ
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55

【参考文献】