5’-核苷酸酶YB92的结构与功能的研究

发布时间：2020-04-08 03:19

【摘要】：5'-核糖核苷酸水解酶简称5'-核苷酸酶(5'-NT),5'-NT能够水解多种核糖核苷-5'-磷酸和脱氧核糖核苷-5'-磷酸,最终生成相应的核苷和无机磷酸。在生物细胞中有多种酶参与核苷酸的生物合成和代谢分解,以保证核苷酸和核苷的量处于适当水平。核苷酸和核苷的库存量保持动态平衡,这有利于实现DNA和RNA的有效合成。由于5'-NT能够催化5'-核苷酸产生相应的核苷和磷酸从而能够调节体内核苷酸和核苷水平,这一机制在体内发挥着重要作用。与核苷酸酶作用相反的是核苷酸激酶,核苷酸激酶能够催化核苷与无机磷酸生成相应的核苷酸。5'-核苷酸酶的分布较为广泛,例如细菌、植物细胞和脊椎动物组织等都含有5'-核苷酸酶。根据5'-核苷酸酶含有的保守结构域分类,主要分为HAD家族和HD家族,HAD家族的5'-核苷酸酶目前研究较多,HD家族的5'-核苷酸酶在真核生物中尚未有研究。YB92是一种重要的5'-核苷酸酶,它能够将5'-核苷单磷酸水解为相应核苷和磷酸。YB92结构上含有HD结构,具有HD结构域的蛋白可具有核苷酸酶和磷酸二酯酶活性,并且它们在信号传导和核苷酸代谢中起重要作用。我们利用生物化学方法和结构生物学方法对酿酒酵母的HD结构域蛋白YB92(YBR242W)的结构和功能进行研究。通过核苷单磷酸与YB92反应实验,表明了YB92(YBR242W)是核苷5'-单磷酸水解酶,YB92蛋白的脱氧核糖核苷5'-单磷酸酶的活性超过核糖核苷5'-单磷酸酶的活性;核苷三磷酸抑制试验表明,核苷三磷酸抑制YB92(YBR242W)水解核苷单磷酸。通过对YB92蛋白进行大规模的纯化表达,将蛋白进行蛋白质晶体生长条件筛选和优化,得到了质量较高的晶体,用X射线对晶体进行衍射,解析了 YB92-ATP复合物的晶体结构。从结构上看,YB92是由8个α螺旋和4个反向平行的β折叠组成。通过比对发现YB92的结构类似于来自大肠杆菌的HD家族的YfbR晶体结构,将两个结构叠加后,推断YB92可能和YfbR具有相同的催化底物结合位点。分子筛柱层析色谱和交联实验研究表明,溶液中的YB92蛋白以二聚体形式存在,这与YB92结构的观察的结果和分析结果一致。我们将HD结构域活性中心附近的一些保守氨基酸进行定点突变,发现与二价金属配位氨基酸残基以及活性位点附近保守残基对YB92活性至关重要。与金属离子配位Asp79、His80、His108和Asp109残基,活性位点附近的保守E112和E133点对催化活性是至关重要的。此外,从结构上看,YB92的K59穿过界面进入到另一单体靠近活性中心位置,我们推测K59与相邻分子中的活性中心部分氨基酸残基(E75/E181/Q185)有氢键相互作用,我们用生化实验进一步验证了K59影响整个YB92的催化活性。总之,我们结构比对和突变研究结果表明YB92在酿酒酵母中起5'-核苷酸酶的作用。
【图文】：

两者都是活性中心中一个天冬氨酸亲核发生攻击，在附近的另一个天冬氨酸作为逡逑电子供体，攻击各种底物的碳原子和磷酸盐之间的分子键＇其具体的作用方式逡逑如图１．１所示：逡逑ｑ邋ｈａｌｏａＯｉａｎｏａｆｅｄｅｈｔｆｏｇｅｎａｓｅｓ逦＾逡逑Ｃ－Ａ．ｐ＾00＾Ｔｒ＾Ｃ＾逦二ｙ0—＿．Ｅ－Ａ？Ｐ－＜0０＊逦ｌ逡逑ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ邋ａｎｄ邋ＡＴＰａｓｅｓ逦ｒ0ｈ逦＾逦ｆ邋Ｍ逦ＭＯ＾逡逑Ｅ－Ａｓｐ－＜＾逦ＯＲ逦Ｅ邋}0邋＜＜＾－｜一。０—？邋Ｅ－Ａ＊ｐ－＜邋ｑ邋？邋ＦＯ，逦Ａｓｐ邋ｎ邋，邋’邋ｆ＼逡逑0逦０卜邋ＣＨｌ－ＣＨ邋ｉｅ逦°逦／邋／＾Ｒ逡逑ｐｈｏｓｐｈｏｒａｔｅ＊逦ｐ逦ＨａＯ逦Ｃ0逦0……—ｇ２，”。＿邋＼逡逑一Ｅ－一令邋ＰＯ．．．岕１邋Ｖ、。丫0逡逑她逦Ｅ逦０逦Ａｉ＾ｌｕ逦Ａ＾？Ｇｉｕ逡逑Ｊ＞邋0逦＾逦ｊＰ邋Ｏ逦ＭｏＭＡ逦Ｍｏｔｉｆ邋４逡逑一－0ｅ邋—，逦ＣＨｌ0Ｊ＿0ｅ＿＿Ｅ－＊＊＞－＜０＿｜＿0ｅ逡逑．屒Ｗ逡逑图１．邋１邋ＨＡＤ水解酶家族反应机理逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ＨＡＤ邋ｈｙｄｒｏｌａｓｅ邋ｆａｍｉｌｙ逡逑通过解析ＨＡＤ结构域的蛋白结构，发现ＨＡＤ磷酸酶在核心结构域中具有独特逡逑的ＨＡＤ折叠方式，其特征是由重复ａ邋／ｐ单元组成的三层ａ逦三明治结构ｍ］。逡逑核心结构域中的活性位点具有四个环构建的基序（基序Ｉ－ＩＶ）。基序Ｉ

两者都是活性中心中一个天冬氨酸亲核发生攻击，在附近的另一个天冬氨酸作为逡逑电子供体，攻击各种底物的碳原子和磷酸盐之间的分子键＇其具体的作用方式逡逑如图１．１所示：逡逑ｑ邋ｈａｌｏａＯｉａｎｏａｆｅｄｅｈｔｆｏｇｅｎａｓｅｓ逦＾逡逑Ｃ－Ａ．ｐ＾00＾Ｔｒ＾Ｃ＾逦二ｙ0—＿．Ｅ－Ａ？Ｐ－＜0０＊逦ｌ逡逑ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ邋ａｎｄ邋ＡＴＰａｓｅｓ逦ｒ0ｈ逦＾逦ｆ邋Ｍ逦ＭＯ＾逡逑Ｅ－Ａｓｐ－＜＾逦ＯＲ逦Ｅ邋}0邋＜＜＾－｜一。０—？邋Ｅ－Ａ＊ｐ－＜邋ｑ邋？邋ＦＯ，逦Ａｓｐ邋ｎ邋，邋’邋ｆ＼逡逑0逦０卜邋ＣＨｌ－ＣＨ邋ｉｅ逦°逦／邋／＾Ｒ逡逑ｐｈｏｓｐｈｏｒａｔｅ＊逦ｐ逦ＨａＯ逦Ｃ0逦0……—ｇ２，”。＿邋＼逡逑一Ｅ－一令邋ＰＯ．．．岕１邋Ｖ、。丫0逡逑她逦Ｅ逦０逦Ａｉ＾ｌｕ逦Ａ＾？Ｇｉｕ逡逑Ｊ＞邋0逦＾逦ｊＰ邋Ｏ逦ＭｏＭＡ逦Ｍｏｔｉｆ邋４逡逑一－0ｅ邋—，逦ＣＨｌ0Ｊ＿0ｅ＿＿Ｅ－＊＊＞－＜０＿｜＿0ｅ逡逑．屒Ｗ逡逑图１．邋１邋ＨＡＤ水解酶家族反应机理逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ＨＡＤ邋ｈｙｄｒｏｌａｓｅ邋ｆａｍｉｌｙ逡逑通过解析ＨＡＤ结构域的蛋白结构，发现ＨＡＤ磷酸酶在核心结构域中具有独特逡逑的ＨＡＤ折叠方式，，其特征是由重复ａ邋／ｐ单元组成的三层ａ逦三明治结构ｍ］。逡逑核心结构域中的活性位点具有四个环构建的基序（基序Ｉ－ＩＶ）。基序Ｉ
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55

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本文编号：2618812