夹心平板技术在海洋细菌资源挖掘中的初步应用及三株新菌的分类鉴定

发布时间：2020-04-08 04:58

【摘要】：宏基因组和单细胞测序方法不仅可以检测到环境中未培养微生物所含有的未知基因,而且可以发现这些未培养微生物潜在的重要代谢功能和生态位;但是,这些以基因或基因组为基础的技术不能对培养物进行全面仔细的研究,获得菌株的纯培养仍然是非常必要的;为了解决这个问题,目前己开发出多种未培养细菌的培养方法,但对细菌的纯培养中仍有许多困难亟待解决,如分离效率的下降,优势菌群对其他物种的影响,细菌细胞间信息的交流对生长的影响分离过程中所涉及的高端仪器的使用问题等。本文以实验室常用的培养基和可培养细菌为基础,结合自然界中细菌个体之间会产生相互作用的现象,设计了夹心平板技术,并且通过对海洋细菌的多样性研究对本方法进行了初步的验证。夹心平板技术中,夹心培养基共分为上、中、下三层;下层为实验室常用的2216E培养基,上层为改良的1/10 2216E培养基,中间用可培养细菌作为夹心菌株;通过对夹心菌株的涂布面积,夹心菌株的处理方式,上层培养基琼脂的浓度等方面的优化,最终确定夹心菌株在下层培养基表面涂布区域的直径约为70mm,上层培养基的琼脂浓度为4%(w/v),并且直接将上层培养基倾倒在夹心菌株表面。采用夹心平板法对威海近海沉积物中的细菌多样性进行研究,结果表明:实验组S25、S63、S69和S70在其夹心菌株的作用下可以使表面细菌的多样性增加,而S08、S09、S12、S38和S39组在其夹心菌株的作用下可以使表面细菌的多样性降低;在属水平,各实验组中优势菌群丰度变化较为明显的是Psychrobacter、Ruegeria、、Microbulbifer、Aequorivita和Bacillus五个属;在潜在新物种方面,各组在夹心菌株的作用下均可以增加新菌的比例,尤以S08、S25、S38、S39、S69 和 S70 组最为明显,并且Flavbbacteriaceaae、Moraxellaceae、Rhldobacteraceae、Halomonadaceae和Phyllobacteriacea 等科的潜在新物种在各组之见差异性较为明显;通过纯培养,共得到481株菌,分布于Actinoba和Pria、Bacteroidetes、Firmicutes和Prottobacter 4 4个门中,其中共有149株潜在新物种,新种124株,新属新种24株,新科新种1株;并且,通过对分离菌株的筛选和验证,得到17株具有生长依赖现象的菌株。此外,本文对三株新菌进行了多相分类。菌株M1309~T分离于威海海参养殖池沉积物,为革兰氏阴性菌,杆状且具有滑动性;生长温度范围16-42℃,最适生长温度为37℃;生长pH范围为6.5-8.0,最适pH为7.0-7.5;生长盐度范围为 2.0-6.5%(w/v)NaCl,最适盐度为 2.0-3.0%(w/v)NaCl;根据 16S rRNA基因序列构建系统发育树,发现菌株M1309bT属于Winogradskgella属,与其最相似的物种为Winogradskyella porferorum JCM 12885~T,相似度为95.5%;通过对菌株M1309~T的化学特征分析,发现其呼吸醌型只有一种为MK-6,主要脂肪酸种类为iso-C_(15:0)、iso-C_(15:1) G和iso-C_(17:0) 3-OH,主要极性脂为PE、两种AL和三种未知的脂肪酸L;基因组DNA含量为36.1mol%;根据表型的特异性和系统发育的差异性,认为菌株M1309~T为Wnogradskye为属的新物种,并将其命名为Winogradskyella tangerina;模式菌株为 M1309~T(=KCTC 52896~T= MCCC 1K03310~T)。菌株ELS1360-T分离自内蒙古湖泊沉积物,为革兰氏阴性菌、兼性好氧、运动形式为滑动、菌体为杆状、菌落为粉红色;在不含NaCl的R2A培养基上,温度为33℃,pH为6.5-7.0时生长最佳;根据16S rRNA基因序列,菌株ELS1360~T与菌株Hymenobacter luteus JCM 30328~T和Hymenobacterlatericoloratus JCM 30327~T最为相似,相似度分别为96.9%和96.8%,与Hymenobacter属的其他成员的相似度均在90.3-96.7%之间;通过发育树分析菌株ELS1360~T属于Hymenobacter属,并且与菌株Hymenobacterluteus JCM 30328~T和Hymenobacte lericoloratul JCM 30327~T聚在一枝;呼吸醌型为MK-7;主要脂肪酸为iso-C_(15:0),Summed feature 3和C_(16:1)ω5c;主要极性脂为PE、APL和未知的脂肪酸L;基因组DNA的G+C为57.1mol%;通过系统发育、表型、基因型和化学分类学分析,认为菌株ELS1360~T是Hymenobacte是属的一个新物种,并命名为Hymenobacter sediminis;模式菌株为ELS1360~T(=KCTC62449~T=MCCC 1H00319~T)。菌株N24~T分离自西安温泉水,为革兰氏阴性菌、具有滑动性、杆状(宽约0.4-0.8μm,长约1.8-7.8μm);最适生长温度为33℃,最适生长pH为7.0;可以产生胞外多糖;通过系统发育树分析,发现菌株N24~T在Chitinophagaceae科中形成单独的一枝,最相似的属为Flavisobacter、Cnuella、Niveitalea、Flavitalea、Flaviaiaturariibacter和Niatella,16S rRNA基因的相似度为91.7-93.9%;主要脂肪酸种类为iso-C_(15:0)(31.8%)、iso-C_(17:0) 3-OH(16.1%)和iso-C15：1 G(12.9%);极性脂成分为PE、两种AL和六种未知的脂肪酸L;呼吸醌型为MK-7;基因组DNA的G+C含量为49.3mol%;通过系统发育、表型、基因型和化学分类学分析,认为菌株N24~T是Chitinophagaceae科的一个新属新种,并命名为Paracnuella aquatica;模式菌株为N24~T(=KCTC62083~T=MCCC 1H00301~T)。
【图文】：

共培养,依赖型,培养菌

养皿底部铺一层１．５％琼脂的固体培养基，之后，倾倒含有潜在助长菌（生长状逡逑况较好）的０．４％琼脂软培养基，铺上带有滤膜的聚丙烯环后，在滤膜上倾倒含逡逑有潜在依赖型菌株（生长状况较差）的软琼脂培养基（如图１－１所示），培养后逡逑观察表面菌落的生长状况［６４］；利用此技术筛选到了逦ｓｐ．邋ＢＬ１５７和逡逑Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ邋ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ邋ＢＬ１７５，Ｂａｃｔｅｗｉｄｅｓ邋ｆｒａｇｉｌｉｓ邋ＢＬ５３９邋和邋Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ邋ｓｐ．邋ＢＬ２５２逡逑等多组具有助长作用的细菌。逡逑＿邋．一逡逑图１邋一１单菌落共培养装置示意图逡逑Ｆｉｇ邋１—１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｓｉｎｇｌｅ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｄｅｖｉｃｅ逡逑共培养技术的出现，在一定程度上说明，，易培养的细菌菌株对难培养或生长逡逑依赖型细菌的培养具有一定的促进作用；但，目前开发出的共培养技术及筛选生逡逑长依赖型菌株的方法的应用的前提基本是先获得难培养菌株的纯培养物，之后再逡逑用易培养菌株刺激其生长，并不能直接用于从环境样品中分离未培养、难培养或逡逑生长依赖型菌株；此外，共培养技术仍不太成熟，需要进一步的开发。逡逑１．３立题依据逡逑任何一种细菌都必须先在体外培养，然后才能全面研究其生理生化特征，才逡逑５逡逑

示意图,表层污染,示意图,培养基

图２－１夹心平板表层污染示意图逡逑ａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｓａｎｄｗｉｃｈ邋ｐｌａｔｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｃｏ下层培养基表面的涂布面积逡逑养基表面的涂布区域直径设置约为４０、，上层１／１０邋２２１６Ｅ培养基冷却到５０°Ｃ左覆盖一层玻璃纸或滤纸逡逑后，在表面覆盖一层玻璃纸或者滤纸片积大，操作时尽量使两者与培养基表面层培养基从滤纸片或玻璃纸的中心开始察，每组实验设置１０个平行，重复３培养基混合后再倾倒上层培养基逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q93

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