活性硫烷硫的荧光特性及生理功能研究

发布时间：2020-04-10 01:10

【摘要】：硫化氢(H2S)是一种新型的气体信号分子,参与生物体内多个生理过程,包括凋亡、血管稳态和再生、神经传递调节、细胞保护以及炎症调节等方面。H2S在体内可以转化为硫烷硫,二者通常共存,最近的很多研究表明,在某些生物学现象中,可能硫烷硫才是潜在的信号分子。硫烷硫(sulfane sulfur)在体内普遍存在,扮演着调节和抗氧化的角色,主要包括有机过硫化物(R-SSH),有机多硫化物(R-SSnH或RSSnR,n≥2)和无机多硫化物(H2Sn,n≥2)三类。硫烷硫和硫醇有很大的不同,后者主要表现为亲核性,而硫烷硫既有亲核性又有亲电性。硫烷硫可由H2S的硫氧化途径、半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸的代谢途径产生,其中间产物GSSH是线粒体和异养细菌硫化物氧化途径中的关键产物。活性硫烷硫通过对细胞内功能蛋白的半胱氨酸残基进行修饰,形成过硫化物(R-SSH)的形式后改变酶活,或以信号传递的方式调节生物体的活性,从而影响生理过程。硫氰酸酶(rhodanese),广泛存在于多种细胞内,催化机制之一就是通过形成酶的中间体R-SSH,将硫烷硫从硫代硫酸盐转移给氰化物从而达到氰化物解毒的目的。越来越多的证据表明活性硫烷硫在体内的重要性,而更好地了解与生物密切相关的硫烷硫的生化特性将有助于推动这一领域的进一步发展。目前用于硫烷硫的检测方法有很多,包括硫化学发光法、离子色谱法、多硫化物(polysulfides,H2Sn)衍生物的高效液相色谱分析和H2Sn敏感荧光染料的应用。这一类的方法都是基于化学反应来检测,目前还未见一种能够实时探测活性硫烷硫的非化学反应方法报道。H2S的浓度至关重要,其生物毒性表现为明显的剂量效应,高浓度的H2S会对线粒体中细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase)的活性产生抑制作用,进而影响电子传递,抑制呼吸作用等。有些异养细菌能够氧化硫化氢生成多硫化物(在硫醌氧化还原酶SQR和过硫化物双加氧酶PDO的作用下),进一步氧化成亚硫酸盐和硫代硫酸盐,氧化代谢产物的毒性则远小于H2S。Cupriavidus pinatubonensis JMP134是 β-变形菌纲的革兰氏阴性菌,在芳香族化合物降解方面和生物技术等方面应用广泛。课题组的前期研究发现,JMP134中存在一个硫氧化基因簇pdo-sqr,操纵子受到上游Fis家族的σ54依赖型转录因子FisR的调控。FisR具有增强子蛋白bEBP的典型结构,蛋白内部分为三个结构域,R结构域的三个半胱氨酸是感应硫烷硫的关键调控位点;AAA+结构域具有水解酶活性,D结构域可以和启动子上游的序列结合。但FisR的调控模型尚不清楚,结构域之间如何相互作用也不确定。为了解决以上问题,本文开发了一种快速、灵敏的荧光扫描光谱法对硫烷硫的荧光特性、FisR的调控机制及RhoD的催化功能开展以下研究内容:1.用荧光分光光度计设置同步扫描激发光和发射光,对硫烷硫进行荧光同步扫描光谱(resonance synchronous spectroscopy,RS2)的研究。通过对 14种含硫化合物的荧光同步扫描结果分析发现,只有当分子内部含有亲电形式的S=S时,硫烷硫才有RS2的特异性光谱;用RS2的方法,可以用于硫烷硫的生化性质的分析,如pKa的测定,反应动力学速率测定,小分子蛋白过硫化物pH依赖的硫烷硫活性等。依据这一发现,对无机多硫化物的生化特性进行了研究,研究结果显示无机多硫化物在低浓度下极不稳定,在生理条件(pH7.4)下,会和胞内的GSH快速发生反应,半衰期约为1min。质子化的GSSH是亲电体,具有荧光同步光谱的特征峰。解离的GSS'是亲核体,易被氧化,不具备该特征峰。利用该特性确定了 GSSH的解离常数pKa为6.9。在pH7.4条件下,GSSH/GSS'和H202的二级反应速率比H2S/HS'和H202高50倍,说明类似于GSSH/GSS'的活性硫烷硫可能在胞内起主要的抗氧化作用。半胱氨酸的过硫化修饰是细胞内蛋白的常见修饰形式,参与了多种代谢过程,以负责氰化物解毒的两种硫氰酸酶RhoD为模型,研究了蛋白活性位点口袋的功能,结果显示半胱氨酸在胞内的过硫化修饰状态也存在两种形式:a.去质子化的形式(R-SS-),不显示RS2特征峰,不能和亚硫酸盐反应;b.质子化形式(R-SSH),有RS2特征峰,可以和亚硫酸盐反应生成硫代硫酸盐。用RS2的方法对大肠杆菌及其重组菌进行了全细胞分析,研究结果发现,荧光同步扫描RS2光谱的形状、强度和硫烷硫的种类、浓度及缓冲体系pH都密切相关,这在一定程度能够揭示活性硫烷硫在胞内分布的物质种类和相对含量。RS2是一种利用物质的荧光特性快速、灵敏、简便的测定活性硫烷硫的方法,可以揭示活性硫烷硫的新的生化性质,利用该方法测定的GSSH的pKa、动力学反应参数、H2Sn在不同pH值下的分布等,有望填补硫烷硫研究领域的空白。2.硫氧化途径是异养菌C pinatubonensis JMP1 34产生硫i烷硫的重要来源之一,我们发现了一种新的依赖于σ54的转录因子,它既是硫化物感应器,又是JMP134中硫化物氧化途径的转录调节因子。当胞内多余的H2S转化为多硫化物时,FisR激活σ54依赖的操纵子转录,来降低H2S的浓度,减少对细胞的毒害作用。我们首先确定了 FisR蛋白的三个半胱氨酸是感应多硫化物的关键位点,进一步研究了 FisR结合在pdo-sqr 操纵子上游的具体位点及其通过ATP水解酶活性激活下游基因转录的方式。转录因子可以通过多种方式调节自身的聚合状态,常见的调节方式有D结构域结合在操纵子上游或R结构域的磷酸化。FisR转录因子的蛋白聚合是依赖R结构域的,蛋白表达后随即形成六聚体结合在JMP134的pdo-sqr操纵子上游的调控区:大多数σ54依赖型调控因子对于AAA+结构域的水解酶活性是负调控的,而我们的研究证明FisR属于多硫化物激活后的正调控。针对以上研究结果,提出了 FisR转录因子对外界硫化物压力产生快速应答的“待命状态”模型,该模型的核心机制是:本底表达的少量SQR蛋白将外源多余的硫化物转化为多硫化物(Km值较低,反应易发生),激活FisR转录因子,FisR通过自身的水解酶活性起始下游基因的转录。从生物信息学的角度分析FisR同源的调控蛋白可能是含有pdo-s科r基因簇的异养菌抵抗外界环境中硫化物压力的一个共同的策略。3.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是研究的比较多的模式生物,在利用硫代硫酸盐为硫源生长时比利用硫酸盐时产生更多的酒精。S.cerevisiae.的细胞内有五种硫转移酶,分别是Rd11、Rd12、Tuim1、Ych1和Uba4,其中Rd11和Rd12负责将硫代硫酸盐的硫烷硫转移给硫受体形成过硫化物和亚硫酸盐,Tuim1(tRNA-thiouridine modification protein 1)在Urm1 系统的硫转移过程中起着重要的作用。DUF442是Cupriavidus pinanibonensis JMP134 中CpSQR(硫醌氧化还原酶,Reut 3588)的一个结构域,不但具有硫氰酸酶的性质,还在硫氧化系统中参与硫化物的代谢,一方面它能加速SQR的产物多硫化物和GSH的反应速度,另一方面催化GSSH和S032'的反应。DUF442结构域由128个氨基酸组成,其中有2个半胱氨酸残基,分别位于34位和94位,只有94位的半胱氨酸为保守的活性位点。将与GSSH孵育后的DUF442蛋白进行质谱鉴定,结果显示34位和94位的半胱氨酸都会被修饰,且修饰的蛋白过硫化物在pH7.4条件下能够检测到明显的荧光同步光谱,但94位半胱氨酸突变的DUF442突变体没有荧光光谱。利用RS2的方法测定了 Cys34-SSH的pKa为6.29。因此在生理条件下,只有野生型的和34位半胱氨酸突变的C94-SSH才能将硫烷硫转移给亚硫酸盐形成硫代硫酸盐。以 Rd12 和 DUF442 为研究模型,分别选择 Saccharowyces cerevisiae(PDB ID:3DIP,分辨率0.98 A,相似性40%),和 Neisseriaa meningitidis z2491(PDB ID:2F46,分辨率1.41 A,相似性39%)的结构为模板进行了 3D同源建模的结构预测和生物信息学分析,发现RhoD蛋白的催化活性位点呈口袋形状,保守的半胱氨酸位于口袋的底部,周围的碱性氨基组成了一个强静电场结构,因此蛋白过硫化物protein-SSH在口袋内部会呈现质子化状态,而不会解离成protein-SS-的形式,因此具有RS2荧光同步扫描光谱和亲电性。本文首次解析了Rd12过硫化物(RhoD-SSH)的晶体结构,分辨率为2.47 A,RhoD-SSH是硫转移反应的关键中间体,精氨酸残基对催化位点起关键作用,突变后会显著影响RhoD的酶活性,thiosulfate孵育的Rd12蛋白的质谱鉴定结果显示Rd12的氨基酸被过硫化修饰形成Rd12-SSH的形式,和复合物蛋白晶体结构的分析结果一致。综上,本论文分析了活性硫烷硫的代表化合物,包括多硫化物和过硫化物的理化性质和荧光特性等,并对与硫烷硫密切相关的代表性蛋白(硫代谢调控蛋白和硫转移蛋白)在体内的生理功能进行了研究,为进一步揭示硫烷硫在生物体内参与调节作用和信号传递的机制提供理论依据和技术支持。
【图文】：

半胱氨酸,哺乳动物,硫烷,亚硫酸盐还原酶

ＣＢＳ主要存在于中枢神经系统和肝脏中，３－ＭＳＴ主要位于线粒体内，逡逑与半胱氨酸转氨酶（ｃｙｓｔｅｉｎｅ邋ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣＡＴ）共同产生Ｈ２Ｓ［９，１０，１１，１２］。逡逑图１．１ｂ概述了哺乳动物Ｈ２Ｓ内源产生的途径［１３］。逡逑Ｈ２Ｓ在细菌体内的产生方式主要有三种：ａ．硫酸盐还原细菌（ｓｕｌｆａｔｅ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ逡逑ｂａｃｔｅｒｉａ，邋ＳＲＢ）的硫酸盐还原作用；ｂ．硫细菌（ｓｕｌｆｉｉｒ邋ｂａｃｔｅｒｉａ）对单质硫的还原；逡逑ｃ．异养微生物胞内产生Ｈ２Ｓ。逡逑Ｒｎｙｉｒｕｎｍｅｎｕｌ邋ＨｉＳ逦ＭｔｃｒｏｂＵｌＨｊＳ逡逑邋一逡逑Ｉ＞ＳＲ逡逑ＭＶ逡逑ｔ邋？邋Ｔ邋Ｖ逦３ＭＳＴ逡逑（ａ）逦（ｂ）逡逑Ｉｎｌｒａｉｒｌｌｕｌａｒ邋Ｈ？Ｓ逡逑＜邋Ｉ）邋ＰｒｏｄｕｔｉｌＫｉｎ逦（２）邋Ｍｏｒａｇｒ逦（３）邋Ｉ邋Ｖｇｒａ？ｌ？ｔｈｉｎ逡逑ＣＢＳ逡逑图１．１丨丨２Ｓ的来源丨１３｜。（ａ）环境中的Ｈ２Ｓ来源与火山、硫矿、热泉等；（ｂ）微生物产生Ｈ２Ｓ，逡逑亚硫酸盐还原酶还原硫酸盐到比５，某些细菌利用和哺乳动物同源的ＣＢＳ，邋ＣＳＥ和３－ＭＳＴ酶逡逑降解半胱氨酸产生Ｈ２Ｓ；邋（ｃ）内源性Ｈ２Ｓ的产生途径主要有半胱氨酸降解、硫烷库的活性硫逡逑转化为Ｈ２Ｓ、线粒体中硫氧化代谢途径；逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｓｏｕｒｃｅｓ邋ｏｆ邋ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｓｕｌｆｉｄｅ［１３］．邋（ａ）邋Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ邋ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｓｕｌｆｉｄｅ邋（Ｈ２Ｓ）邋ｏｃｃｕｒｓ邋ｄｕｅ逡逑ｔｏ邋ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｓｕｃｈ邋ａｓ邋ｖｏｌｃａｎｏｅｓ

酶催化,途径,胱硫醚

１．２．１胱硫醚个裂解酶ＣＳＥ逡逑ＣＳＥ主要催化ＰＬＰ邋（ｐｙｒｉｄｏｘｙｌ邋５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＬＰ）依赖的半肮氨酸和同型半逡逑胱氨酸产生丙酮酸和ａ－酮戊二酸的反应，同时释放出氨（ＮＨ３）和Ｈ２Ｓ邋（图１．２）。逡逑ＣＳＥ主要位于细胞的细胞质中，多分布于心血管系统中，，并被认为是心脏病的可逡逑能药物作用靶点，研宄表明调节ＣＳＥ的活性对治疗动脉粥样硬化和其他心血管逡逑疾病的动物模型有一定的影响［１４］。最近的研宄表明，ＣＳＥ产生的Ｈ２Ｓ对减轻心逡逑肌缺血－再灌注（Ｉ／Ｒ）损伤和减轻心律失常减少心肌梗死等方面具有许多保护作用逡逑［１５，１６］。除了参与心血管系统的活动外，ＣＳＥ还有助于其他器官的细胞信号的传逡逑递和稳态。例如Ｌｅｆｅｒ等发现，抑制ＣＳＥ可减轻Ｄ－半乳糖胺和脂多糖（ＬＰｓ）引起逡逑的肝损伤［１７］，这一影响是由于细胞内硫代硫酸盐和同型半胱氨酸水平增加，逡逑ＮＦ－Ｅ２邋Ｐ４５因子２（Ｎｒｆ２）和抗氧化蛋白等复杂因素的上调所导致的。逡逑１．２．２胱硫醚－Ｐ－合成酶ＣＢＳ逡逑ＣＢＳ催化的是ＰＬＰ依赖的反应，其中Ｌ－同型半胱氨酸和Ｌ－丝氨酸反应生成逡逑Ｌ－胱硫醚和Ｈ２Ｏ［１０］。在Ｌ－半胱氨酸存在的条件下
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q25

【相似文献】