枯草杆菌芽孢皮层裂解酶CwlJ基因的克隆表达、纯化及其水解肽聚糖产物分析

发布时间：2020-04-10 01:13

【摘要】：食品会因芽孢的存在而引发腐败及一些安全问题,但是芽孢却又很难被各种杀菌方法杀灭,所以找到杀灭芽孢的路径迫在眉睫。造成芽孢死亡的关键之处在于芽孢皮层肽聚糖水解,由于芽孢萌发、核心水化、皮层裂解酶被激活,所以芽孢抗性消失,故将皮层裂解酶分离纯化出来就显得尤为重要。从天然菌种中提取皮层裂解酶,工作量大、难以分离纯化且产率还低,所以本文通过基因工程操作技术,构建了皮层裂解酶CwlJ的基因工程菌,以获得大量的皮层裂解酶,为后续试验提供了原材料,为推动CwlJ水解肽聚糖进而杀灭芽孢并应用于食品杀菌奠定了基础。本文研究了枯草杆菌芽孢皮层裂解酶CwlJ基因的克隆及酶生物信息学分析、皮层裂解酶CwlJ的诱导表达及分离纯化、皮层裂解酶CwlJ水解肽聚糖产物分析。主要研究内容及结论如下:(1)为了构建含有皮层裂解酶CwlJ基因的克隆,依据查到的基因序列,设计CwlJ的特异引物,合成CwlJ基因片段后与pCZN 1质粒连接,重组子pCZN 1-CwlJ转化Topl0感受态细胞,阳性克隆测序结果采用NCBI和ExPASy网站中的各种信息分析工具,并结合DNAMAN软件对CwlJ基因序列进行生物信息学分析。结果表明:CwlJ蛋白是一种碱性、不稳定、亲水、非分泌性蛋白;其二级结构中a-螺旋占26.06%,β-折叠占21.83%,β-转角占4.93%,无规则卷曲占47.18%;CwlJ基因表达的酶蛋白形成包涵体的可能性为68.11%;系统进化分析中枯草芽孢杆菌皮层裂解酶CwlJ与苏云金芽孢杆菌皮层裂解酶CwlJ、苏云金芽孢杆菌Bt18247皮层裂解酶CwlJ亲缘关系较近。以上结果为后续CwlJ基因的异源表达、纯化与功能研究提供了参考信息。(2)为了获得大批量的皮层裂解酶CwlJ,运用IPTG诱导重组菌表达目的蛋白CwlJ,SDS-PAGE和Western-Blot检验重组皮层裂解酶的表达情况,并用亲和层析法纯化重组蛋白CwlJ。研究发现0.5 mM的IPTG能实现CwlJ基因的大量表达,纯化后的重组皮层裂解酶CwlJ分子量为17.9KD,最适温度为40℃、最适pH值为5,比酶活力146.67U/mg,相比从天然芽孢中提取出来的皮层裂解酶,重组皮层裂解酶的活性提高了 2倍,保证了皮层裂解酶CwlJ进一步水解肽聚糖实验的进行。(3)为了进一步了解酶水解肽聚糖的产物特点,先提取了芽孢皮层肽聚糖,然后分析了在酶CwlJ的参与下肽聚糖的水解产物。研究发现,水解产物的SDS-PAGE图中共有7条蛋白条带,质谱数据显示水解产物中有蛋白质1300种,分子量以20～40KD居多,肽段2609个;氨基酸分析中显示水解产物中有四种游离氨基酸,分别是赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸;水解液中蛋白质含量0.1600 mg/mL、NAG含量0.1625 mg/mL;元素分析中表明水解产物中C、N比为2.95%,C、H 比为 5.88%。本研究构建了皮层裂解酶CwlJ的基因工程菌,成功诱导表达,并纯化出有活性的CwlJ,为后续实验提供了研究材料。肽聚糖水解产物分析中蛋白种类1300余种,不排除肽聚糖提取不纯的原因,对水解产物进行分析,其分析结果为后继研究肽聚糖水解进而杀灭芽孢的其他杀菌技术提供对照与参考信息。
【图文】：

２．２．１皮层裂解酶Ｃｗ／Ｊ基因的克隆逡逑根据己知的Ｃｗ／Ｊ基因序列，合成目的基因ＣＷ。合成产物进行１％琼脂糖凝胶电泳，结果逡逑见图２－２。由图２－２可知，所得产物大小约为４５０邋ｂｐ，目的条带上方出现的阴影可能是引物不特逡逑－１０－逡逑

■逡逑（注：Ｍ为ＤＮＡ分子量标准；１泳道为Ｃｗ／Ｊ基因ＰＣＲ产物）逡逑图２－２邋ＣＶ／Ｊ基因ＰＣＲ扩增产物电泳图逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ＣｗｌＪ邋ｇｅｎｅ逡逑目的基因Ｃｗ／Ｊ克隆至质粒ｐＣＺＮｌ后的双酶切验证，，结果见图２－３。由图２－３可知，显示所逡逑切掉的片段和克隆序列大小一致，可确定Ｃｗ／Ｊ己经插入质粒ｐＣＺＮｌ中。逡逑ｂｐ逦Ｍ逦１逡逑一逡逑０．５邋Ｋｂ邋—焌逡逑（注：Ｍ为ＤＮＡ分子量标准；１泳道为双酶切结果）逡逑图２－３双酶切鉴定结果逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｄｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑测序结果见图２－４。由图２－４可知，该克隆基因全长４４０邋ｂｐ，与克隆序列一致，且开放阅读逡逑框架正确。由此得出结论ｐＣＺＮ邋１－ＣＶ／Ｊ重组载体构建成功［７６］。逡逑１逦ＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡ邋ＣＧＣＴＴＣＡＡＡＡ邋ＴＣＴＧＴＡＡＡＧＣ邋ＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣ邋ＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣ邋ＡＣＡＣＴＴＡＡＴＴ逡逑６１逦ＡＴＴＡＡＧＡＧＧ丁邋ＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴ邋ＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡ邋Ｇ丁ＧＣＡＴＣＡＴＣ邋ＡＴＣＡＴＣＡ１｜ＣＡＴＡＴｇ｜ｇＣＡＧＴＴ逡逑１２１邋ＧＴＴＣＧＴＧＣＧＡ邋ＣＣＡＧＣＧＣＧＧＡ邋ＴＧＴＴＧＡＴＣＴＧ邋ＡＴＧＧＣＧＣＧＴＣ邋ＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣ邋ＧＧＡＡ
【学位授予单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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本文编号：2621539