粪便微生物宏基因组来源的β-半乳糖苷酶的异源表达及酶学性质研究

发布时间：2020-04-10 03:34

【摘要】：乳糖是哺乳动物乳汁及乳制品中存在的主要碳水化合物,当人们饮用牛奶后,在消化过程中乳糖必须被β-半乳糖苷酶催化水解为半乳糖和葡萄糖才能被机体吸收利用。据报道,世界上约有十分之一的人由于体内缺乏β-半乳糖苷酶而患有乳糖不耐受症;饮用牛奶后,身体会出现腹泻、呕吐等不良反应。其中,β-半乳糖苷酶具有很大的商业利用情景,性质优良的β-半乳糖苷酶在生产生活中具有重要的实用价值。β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶的一种,广泛存在于自然界中。根据氨基酸序列的相似性,将β-半乳糖苷酶归入五种糖苷水解酶(Glycoside hydrolases,GH)家族,包括1、2、35、42和59家族。其中,部分β-半乳糖苷酶除了具有水解活性以外,还具有转糖基活性。目前,对β-半乳糖苷酶的研究较多,但尚未有来源于动物胃肠道且具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶报道,以及很少有报道具有耐盐性的β-半乳糖苷酶;由于β-半乳糖苷酶被广泛应用于食品工业、医学和生化分析等邻域,耐盐与否与其运用前景息息相关。本论文研究的β-半乳糖苷酶来源于滇金丝猴粪便微生物宏基因组DNA,通过PCR克隆得到基因galRBM20_1、galRBM20_2、galRBM20_13和galRBM20_15,配合pEASY-E2载体和宿主Escherichia coli BL21(DE3)菌种构建原核表达系统,分别对其进行异源表达和纯化,并对纯化后的重组酶galRBM20_1、galRBM20_2、galRBM20_13和galRBM20_15进行酶学性质研究,结果表明:(1)重组酶galRBM20_1最适pH为5.0,在pH 4.0-7.0之间仍能保持70%及其以上的活性,在pH 5.0-8.0的范围内具有良好的稳定性;最适温度为45℃,37℃和45℃下具有良好的稳定性;大多数金属离子和化学试剂对该酶的活性都具有激活作用;其耐盐性较强,当反应环境中有适当浓度的NaCl或是经一定浓度范围内的NaCl处理后,能明显提高酶的活力。(2)重组酶galRBM20_2最适pH为7.0,在pH 7.0-9.0之间仍能保持70%及其以上的活性;在pH 5.0-7.0的范围内具有良好的稳定性;该酶温度稳定性良好,最适温度为45℃,55℃处理1 h后还具有45%以上的活性;大多数金属离子和化学试剂对该酶的活性都具有激活作用;该酶具有良好的耐盐性,经一定浓度范围内的NaCl处理后,酶的活力明显提高。(3)重组酶galRBM20_13最适pH为7.0,在pH 7.0-9.0之间仍能保持70%及其以上的活性;最适温度为45℃,在37℃、45℃、50℃和55℃下稳定性良好;1 mM的β-mercaptoethanol、Mg~(2+)、Fe~(2+)对该酶的活性具有明显的激活作用;该酶具有良好的耐盐性,且一定浓度范围内的NaCl处理能提高酶的活力。(4)重组酶galRBM20_15最适pH为8.0,在pH 7.0-9.0之间仍能保持70%及其以上的活性;galRBM20_15受pH的激活作用较强,在pH 5.0-10.0的范围内处理1 h后,酶活均在100%以上,其中pH 10处理1h后,相对酶活达到180%以上;最适温度为45℃,50℃和55℃下稳定性良好;1 mM的β-mercaptoethanol、Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶的活性具有明显的激活作用;该酶具备一定的耐盐性,当反应环境中有2 M的NaCl存在时,仍具有55%的活性。TLC检测结果表明,重组酶galRBM20_1、galRBM20_2、galRBM20_13和galRBM20_15除了能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖以外,还具有转糖基活性;为此,本研究获得的β-半乳糖苷酶不仅能很好的水解乳清、干酪和牛乳(pH 5.0-7.0),而其在具有盐溶液的反应中能发挥良好的反应潜能,较适应β-半乳糖苷酶的广泛用途。
【图文】：

糖苷,机制,β-半乳糖苷酶,乳糖操纵子

第 1 章绪论2图1.1 糖苷水解酶催化机制[2]Fig. 1.1 Glycosidases mechanisms[2]1.1 β-半乳糖苷酶的研究概况β-半乳糖苷酶的研究促使了微生物学的快速发展。例如，法国的雅各(Jacob)和莫诺德(Monod)[6]基于大肠杆菌β-半乳糖苷酶的研究，提出了乳糖操纵子的理论和酶生物合

机理,受体,乳糖,半乳糖

的 C-1 位置，使乳糖的β-D-(1, 4)、β-D-(1, 6)或β-D-(1, 3)糖苷键断裂，生成葡萄糖和半乳糖基-酶复合物。然后，溶液中的水分子向阴离子巯基提供一个质子(H+)，形成带负电荷的底物(含 OH-)进攻酶活性中心半乳糖基的 C-1 位置，形成半乳糖，并将电子传递给咪唑基，酶分子还原，继续参与下一个酶促反应[54,56]。过程为：(1) 酶-乳糖→半乳糖苷-酶+葡萄糖，(2) 半乳糖苷-酶+受体→半乳糖苷-受体+酶。反应第二步在酶的作用下，β-半乳糖苷被转移到含羟基的亲核受体(水和糖类都可作为受体)上，受体为水时生成半乳糖，为水解反应，受体为乳糖或半乳糖等糖类时，则为转糖基反应。乳糖为二糖，在水解为单糖半乳糖和葡萄糖的过程中，当羟基获得质子，且底物进攻半乳糖的 C-1 位置时，形成的产物即为 GOS[56,57]。如第二步反应，若羟基的受体是乳糖水解产生的半乳糖或葡萄糖，则生成聚半乳二糖[58]；若羟基的受体是乳糖，则生成低聚半乳三糖；生成的三糖也可以作为羟基的受体，生成四糖；以此类推，，可生成更高的低聚半乳糖，如图 1.2 所示。通常情况下，当反应体系中乳糖浓度低于水的浓度时，反应类型主要为水解[43,59]，生成的低聚半乳糖很少。因此，如果要提高低聚半乳糖的产量，可通过提高反应体系中底物(受体)的浓度或降低水的浓度实现[60]。
【学位授予单位】：云南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;Q55

【参考文献】