重组人PDGF-Fc融合蛋白的表达纯化及其活性测定

发布时间：2021-07-09 22:35

背景和目的:人血小板衍生因子-BB(PDGF-BB)能够促进多种细胞增殖,参与新生血管的生成及抗凋亡等作用,临床用来治疗皮肤烧伤和重度糖尿病患者的皮肤创伤。构建PDGF-BB优化酶切位点后的表达载体,筛选出稳定遗传和高表达的PDGF-BB的X33毕赤酵母菌株,摸索PDGF-BB重组蛋白的纯化条件,进行蛋白定量和活性测定。方法:通过查询基因组文库并设计目的序列,构建pPICZαA-PDGF-BB-Fc表达载体,利用BTX方波电穿孔仪电击转化到X33毕赤酵母工程菌中表达PDGF-BB蛋白,通过含有博来霉素的YPD固体培养基筛选稳定的PDGF-BB表达菌株。通过对不同诱导表达时间和诱导表达的甲醇浓度条件的优化。然后表达的蛋白经过盐析初步纯化,DEAE阴离子交换层析,Superdex75凝胶过滤层析进一步纯化目的蛋白,为后续的大规模的发酵提供可参考的方案和工艺。结果:成功地构建了PDGF-BB重组蛋白的表达载体,获得了稳定遗传且表达量相对高的重组蛋白菌株。初步建立了完整的PDGF-BB重组蛋白分离纯化体系,纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测纯度达90%,经过活性测定结果显示,重组的PDGF-BB蛋白具有生物学活性能够刺激成纤维细胞增殖。结论:通过构建PDGF-BB重组蛋白的表达载体,优化了重组蛋白的表达和纯化条件,获得了高纯度的PDGF-BB重组蛋白,纯度达90%,并具有良好的生物学活性。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

文章目录

中文摘要

abstract

英文缩略词汇

第1章绪论

1.1 血小板衍生因子

1.2 血小板衍生因子受体

1.3 PDGF-BB与肿瘤

1.4 PDGF-BB与人真皮成纤维细胞

1.5 PDGF-BB与平滑肌细胞

1.6 PDGF-BB与系膜细胞

1.7 PDGF-BB与间充质干细胞

1.8 PDGF-BB的应用

第2章材料与方法

2.1 仪器与试剂

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器

2.1.3 实验试剂的配方

2.2 实验方法

2.2.1 PDGF-BB-Fc表达载体的构建

2.2.2 重组质粒的双酶切鉴定

2.2.3 制作毕赤酵母感受态细胞

2.2.4 重组质粒的酵母电转化

2.2.5 电转化阳性克隆的表达鉴定及筛选

2.2.6 SDS-PAGE电泳检测表达产物

2.2.7 Western blot检测蛋白表达

2.2.8 重组菌株表达条件的优化表达

2.2.9 重组蛋白的纯化

2.2.10 重组蛋白的定量

2.2.11 重组蛋白活性的测定

第3章实验结果

3.1 重组蛋白表达载体的构建

3.1.1 重组PDGF-BB-Fc质粒的双酶切鉴定

3.1.2 重组的毕赤酵母菌株表达产物的SDS-PAGE鉴定

3.1.3 重组的毕赤酵母菌株表达产物的Western blot鉴定

3.1.4 重组的毕赤酵母菌株表达条件的优化

3.2 重组PDGF-BB-Fc表达蛋白的纯化

3.2.1 硫酸铵沉淀

3.2.2 DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析

3.2.3 Superdex75凝胶过滤层析

3.2.4 纯化后蛋白的Western blot鉴定

3.3 PDGF-BB重组蛋白的定量

3.4 PDGF-BB重组蛋白的活性测定

第4章实验讨论

第5章实验结论

参考文献

致谢

【相似文献】