棘孢曲霉绿原酸水解活性酶类的基因克隆表达及性质研究

发布时间：2020-04-13 10:05

【摘要】：绿原酸水解活性酶类泛指可以水解绿原酸的一类酶,主要包括绿原酸水解酶和阿魏酸酯酶2类。绿原酸水解活性酶类可实现对绿原酸的生物降解,在食品和医药等行业有着广阔的应用前景。实验室前期筛得一株高产绿原酸水解活性酶类的曲霉属真菌SD14,其野生酶具有良好的稳定性和底物亲和力,但绿原酸水解活力较低(4.35 U/g)。本研究完成了对该菌株的全基因组测序,根据注释信息筛选,对可能编码绿原酸水解活性酶类的4个基因进行克隆,并实现其在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达。经诱导条件优化,最终获得2个具有绿原酸水解活性的重组酶reFAE1和reFAE2,并进一步对其酶学性质进行探究。主要研究内容及结果如下:(1)交叉比较菌株SD14的ITS区、钙调蛋白和β-微管蛋白基因序列信息,构建系统发育进化树,提高菌种鉴别分辨率,最终确定其为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus),与日本曲霉(A.japonicus)亲缘关系近。采用第三代单分子测序技术完成了对该菌株的全基因组测序、组装和功能注释工作,所得基因组序列总长为36.18Mb,包含18条scaffolds,GC含量为50.11%,组装质量远超过已有报道。(2)以实验室筛得的曲霉属真菌(A.aculeatus SD14)的总RNA反转录获得的cDNA为模板,设计引物扩增获得基因组中可能具有绿原酸水解活性的4个注释基因(GME3292/7542/2693和11122),最终在E.coli原核表达系统中获得可溶性表达。其中2个基因工程菌GME3292-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)和GME11122-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)表达的重组酶检测到绿原酸水解活性,分别命名为reFAE1和reFAE2。(3)从诱导剂浓度、诱导时机、诱导温度和诱导时长4个方面对GME3292-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)和GME11122-pET28a(+)/E.coli BL21(DE3)进行诱导发酵条件优化,确定最佳诱导条件为:OD_(600)=1.2,诱导温度为20°C,诱导时长为20 h,IPTG浓度分别为:0.04和0.02 mmol/L。最终绿原酸水解活力分别为246.37和340.95 U/g,是原始菌株的56.64和78.38倍,较已报道最高绿原酸水解酶活提高43%。(4)通过亲和镍柱层析色谱法对重组酶进行分离纯化,纯化所得reFAE1和reFAE2均为同源二聚体,其单体相对分子质量均在55 kDa左右。重组酶对4种模型底物均有水解活力,其中对咖啡酸甲酯的水解活性最高,香豆酸甲酯次之,阿魏酸甲酯和芥子酸甲酯的水解活性相对较低,对天然底物绿原酸的水解活性与香豆酸甲酯接近。根据底物特异性初步推测,reFAE1和reFAE2均属于C型阿魏酸酯酶。(5)reFAE1和reFAE2水解绿原酸的最适温度分别为60℃和50℃,最适pH均为7.0,在30~50℃条件下具有良好的热稳定性。reFAE1和reFAE2分别在pH 3.0~8.0和pH 3.0~10.0条件下稳定。Mn~(2+)和Ca~(2+)对reFAE2有一定程度的激活作用。EDTA处理对重组酶绿原酸水解活性基本没有影响,一价金属离子对酶活无显著影响,二价金属离子会对酶活造成一定程度的抑制,三价金属离子处理后酶活损失严重。重组酶对绿原酸底物亲和能力较好,K_m分别为79.85μmol和105.98μmol。
【图文】：

奎尼酸,咖啡酸,化学结构式,绿原酸

第一章绪论1 绿原酸及其对食品加工的影响广义的绿原酸指由一个或多个咖啡酸和奎尼酸缩合而成的酯类，根据置和数目可大致分为单酯、二酯、三酯和四酯4类[1]，，目前已从自然界植发现的单酯类绿原酸异构体有绿原酸（5-咖啡酰奎尼酸）、隐绿原酸（4-奎尼酸）、新绿原酸（3-咖啡酰奎尼酸）3 种。狭义的绿原酸（Chlorogid，CGA）仅指由单个咖啡酸与奎尼酸缩合形成的缩酚酸，是植物有氧莽草酸途径代谢产生的一种苯丙素类化合物[2]，其化学结构如图 1-1 所A 广泛存在于自然界植物体中，在咖啡豆、苹果、土豆、向日葵种子及（如杜仲、金银花等）中含量尤为丰富。研究表明，CGA 是重要的生物质[3]，具有抗菌[4, 5]、抗病毒[6, 7]、抗氧化[8]、降血压、降血脂[9]和兴奋中10]等多种生理功能。

氨基酸序列,催化反应

图 1-2 ChlH 催化反应式Fig. 1-2 The catalyzed reaction formulas of ChlH2007 年，Benoit 等[26]分离纯化得到 ChlH，对其蛋白质一级序列进行比，结果显示 ChlH 与真菌产羧酸酯酶和胆酰酯酶的氨基酸序列具有相对较似性，约为 41%和 35%。推测其属于 α/β 折叠水解酶家族，其催化三联中心由 204位丝氨酸、325 位谷氨酸和 390 位组氨酸组成。预测结构模型所示，其中包含 11 个 β-折叠和 9个 α-螺旋结构。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;TS201.25

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