GRSF1通过调控线粒体ROS抑制成肌分化

发布时间：2020-04-13 10:12

【摘要】：富含鸟嘌呤序列的RNA结合因子1(GRSF1)是RNA结合蛋白(RBP)家族的成员之一。GRSF1存在于细胞核,细胞质和线粒体中,在细胞质和线粒体中通过参与RNA的加工,转运和翻译来调节RNA代谢。然而,其在成肌分化中的作用尚未得到研究。在本研究中,我们证明了 GRSF1在线粒体中的表达及其对线粒体功能的影响与小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12的分化负相关。在C2C12细胞内干涉GRSF1能够促进成肌分化。相反,过表达GRSF1则能够抑制细胞分化进程。与此同时,GRSF1表达量的改变并不影响分化早期标志物MyoD的表达或细胞增殖。进一步的研究表明,GRSF1是通过直接靶向线粒体谷胱甘肽过氧化物酶4(m-GPX4)调节成肌分化。m-GPX4是细胞氧化还原状态的关键调节因子,能够调节线粒体ROS(mtROS)的水平,而mtROS在成肌分化过程中具有非常重要的作用。干涉GRSF1或者m-GPX4均能够导致mtROS水平的上升和成肌分化进程加速,而过表达GRSF1或者m-GPX4则会降低mtROS水平以及抑制成肌分化进程。同时,当细胞ROS被抑制时,成肌细胞的分化能力被抑制,干涉GRSF1或者m-GPX4引发的促分化效果也会被抑制。我们的研究结果揭示了骨骼肌生成过程中GRSF1的关键功能在于其对肌肉氧化还原稳态的调节。
【图文】：

图１内源性ＧＲＳＦ１邋ｍＲＮＡ及蛋白表达量逡逑（Ａ）邋Ｃ２Ｃ１２细胞分化过程示意图；（Ｂ）邋Ｃ２Ｃ１２细胞中内源性ＧＲＳＦ１邋ｍＲＮＡ和蛋逡逑的表达量。＊ｐ邋＜０．０５，＊＊ｐ邋＜０．０１，＜０．００１，ｎｓ，无显着性。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ邋ＧＲＳＦ１邋ｍＲＮＡ邋ａｎｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑（Ａ）邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ｍｙｏｂｌａｓｔｓ邋Ｃ２Ｃ１２；邋（Ｂ）逡逑ｔｉｖｅ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ邋ＧＲＳＦ１邋ｎｉＲＮＡ邋ａｎｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｉｎ邋ｍｏｕｓｅ邋ｍｙｏｂｌａｓｔｓ邋Ｃ２Ｃ１２逡逑ｓｕｒｅｄ邋ｏｖｅｒ邋ｔｉｍｅ．邋＊ｐ邋＜邋０．０５，邋＊＊ｐ邋＜邋０．０１，＊＊＊ｐ邋＜邋０．００１，ｎｓ，ｎｏｔ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．逡逑．３．２邋ＧＲＳＦｌ调控Ｃ２Ｃ１２细胞分化逡逑通过使用针对ＧＲＳＦ１的两个不同的ｓｉＲＮＡ邋（ｓｉＧＲＳＦｌ＃ｌ，ｓｉＧＲＳＦｌ＃２）降低ＧＲＳＦｌ逡逑达量来探索ＧＲＳＦｌ的功能作用（图２Ａ）。肌球蛋白重链（ＭＹＨＣ）是成肌细胞的逡逑分化标志物，融合指数代表分化程度。在成肌分化过程中，ＧＲＳＦ１的敲低可以显著逡逑肌球蛋白重链３邋（ＭＹＨ３）在ｍＲＮＡ表达量（图２Ｂ），，针对ＭＹＨＣ的免疫染色可逡逑出蛋白水平也显著升高，融合指数显著上升（图２Ｃ）。相反，ＧＲＳＦｌ的过表达（图逡逑抑制了分化期间ＭＹＨ３的转录和翻译，融合指数显著下降（图２Ｅ，２Ｆ）。逡逑

图３邋ＧＲＳＦｌ对ＭＹＯＤ及增殖的影响逡逑（Ａ）转染后在指定的分化时间点（ＤＯ，Ｄ１和Ｄ３）邋ＭＹＯＤ邋ｍＲＮＡ的相对水平。（Ｂ）逡逑上：转染后诱导分化之前（ＤＯ）的ＭＹＯＤ蛋白免疫印迹。ＢＣＡ测定加载等量的蛋白逡逑质，Ｐ－ａｃｔｉｎ邋（ＡＣＴＢ）是加载对照。下：相对于上样对照的ＭＹＯＤ蛋白质水平的定量。逡逑（Ｃ）在ＧＲＳＦ１沉默或过表达２４小时后，ＥｄＵ邋（红色）掺入Ｃ２Ｃ１２细胞的免疫荧逡逑光，在ＥｄＵ标记３小时后固定细胞。箱型图，在十个视野中测量的ＥｄＵ＋核的百分比。逡逑比例尺，１００邋（ｉｍ。ｎｓ，无显著性。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＧＲＳＦｌ邋ｏｎ邋ＭＹＯＤ邋ａｎｄ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ逡逑（Ａ）邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ＭＹＯＤ邋ｍＲＮＡ邋ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ａｔ邋ｔｈｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｔｉｍｅ邋ｏｆ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋（ＤＯ，邋Ｄ１邋ａｎｄ邋Ｄ３）．邋（Ｂ）邋Ｕｐｐｅｒ：邋Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ邋ｆｏｒ邋ＭＹＯＤ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ逡逑ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ邋ｐｒｉｏｒ邋ｔｏ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋（ＤＯ）．邋Ｅｑｕａｌ邋ａｍｏｕｎｔｓ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑ｗｅｒｅ邋ｌｏａｄｅｄ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ＢＣＡ邋ａｓｓａｙ，邋Ｐ－ａｃｔｉｎ邋（ＡＣＴＢ）邋ｗａｓ邋ａ邋ｌｏａｄｉｎｇ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋Ｌｏｗｅｒ：邋ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＭＹＯＤ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｌｏａｄｉｎｇ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋（Ｃ）邋Ｉ
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q344

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本文编号：2625893