当前位置:主页 > 理工论文 > 生物学论文 >

枯草芽孢杆菌中dlt操纵子对多粘菌素E抗性的影响机制研究

发布时间:2020-05-01 17:54
【摘要】:多粘菌素作为抗多重耐药革兰氏阴性菌的最后一道防线,现在已经被广泛应用于革兰氏阴性菌的治疗。近年来,越来越多的研究表明,阳离子抗菌肽多粘菌素同样可以作用于革兰氏阳性菌。而随着多粘菌素的应用,革兰氏阳性菌中已经发现了应对这种阳离子抗菌肽的抗性机制。dlt操纵子可通过对革兰氏阳性菌细胞壁的丙酰化,对细胞表面的正电荷进行修饰,从而增加对多粘菌素E的抗性。本文着眼于多粘菌素E和枯草芽孢杆菌的相互作用,对dlt操纵子在多粘菌素E的抗性机制中的作用展开研究。本文选取枯草芽孢杆菌WB800来源的dlt操纵子基因和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pWBUC01,设计XhoⅠ和MluⅠ为双酶切位点,经酶切连接在大肠杆菌BW25113中构建dlt操纵子重组质粒pWOP。随后,通过Spizizen化学转化法,将重组质粒pWOP转入枯草芽孢杆菌SCK6中,成功获得dlt操纵子过表达的枯草芽孢杆菌SCK6-2。通过比较多粘菌素E对枯草芽孢杆菌SCK6/pWBUC01(枯草芽孢杆菌SCK6-1)和枯草芽孢杆菌SCK6-2的MIC值,发现SCK6-2比SCK6-1菌株更耐受多粘菌素E,说明dlt操纵子过表达有助于提高枯草芽孢杆菌对多粘菌素E的耐受性。通过比较SCK6-1和SCK6-2菌株在多粘菌素E处理下的生长曲线及CFU,发现dlt操纵子过表达能提高多粘菌素E处理下枯草芽孢杆菌的存活率。为了进一步研究dlt操纵子过表达提高枯草芽孢杆菌对多粘菌素E耐受性的原因,我们比较了多粘菌素E处理下菌株培养上清液的OD_(260nm)和OD_(280nm)下吸光度及NPN荧光值变化,发现dlt操纵子可减弱多粘菌素E对枯草芽孢杆菌通透性的影响。随后,使用阳离子蛋白质细胞色素c表征dlt操纵子过表达后细胞表面净负电荷的变化,发现dlt操纵子的过表达会降低枯草芽孢杆菌与细胞色素c的结合,表明dlt操纵子的过表达可增加枯草芽孢杆菌表面的正电荷,降低净负电荷量,从而减弱带正电荷的多粘菌素E对细胞的静电结合作用。由于多粘菌素E生产菌多粘类芽孢杆菌不含dlt操纵子,dlt操纵子在多粘类芽孢杆菌中表达有望提高其抗性,从而提高多粘菌素E的产量。为此,本实验考察了枯草芽孢杆菌源dlt操纵子在多粘类芽孢杆菌中的表达及其影响。首先优化了多粘类芽孢杆菌ATCC842和多粘类芽孢杆菌C12的电转化条件,建立了最优的电转化体系。接着,构建了含dltA基因的重组质粒pWDA。然后,在电转化最优体系下,将pWDA和pWOP分别电转化多粘类芽孢杆菌ATCC842,发现pWDA能被成功转化,但效率比较低;而pWOP不能被成功转化至菌株ATCC842。可能的原因是多粘类芽孢杆菌电转化效率本身比较低。另外,dlt操纵子比dltA大的多,这进一步增加了pWOP电转化难度。后续实验中,需要进一步提高电转化效率,另外也可以建立更有效的多粘类芽孢杆菌转化方法。由此,进一步研究dlt操纵子表达为提高多粘类芽孢杆菌对多粘菌素E抗性的可能性及其机制,为今后增加多粘菌素E的发酵产量提供新的思路。
【图文】:

粘菌素,多粘菌素B,化学结构,多粘菌素


图 1-1 多粘菌素 B 和粘菌素的化学结构[6]Figure 1-1. Chemical structure of polymyxin B and colistin[6]注:多粘菌素的不同颜色区域如下:黄色,脂肪酰基链; 绿色,线性三肽片段; 红色,七肽的极性残基; 蓝色,七肽环内的疏水基序。多粘菌素B和多粘菌素E 的6 号位置分别是D-Phe和 D-Leu。脂肪酸:6-甲基辛酸或异辛酸或辛酸或庚酸; Thr:苏氨酸; Phe:苯丙氨酸; Leu:亮氨酸; Dab:α,γ-二氨基丁酸。临床上多粘菌素主要应用于革兰氏阴性菌,被广泛接受的作用机制主要是对细胞膜的破坏和对呼吸链的胁迫作用,前者是一种主要机制,而后者常被称为是一种“辅助机制”[10]。在引起细胞膜破坏的机制中,多粘菌素通过静电相互作用结合至革兰氏阴性细菌表面,后通过“自我摄取”机制对细胞膜进行穿孔,对细胞膜的完整性进行破坏从而杀死细菌[2, 3, 8, 11]。在此机制中,多粘菌素中一个重要的结构特征是存在多个带正电荷的 L-α-γ-二氨基丁酸(Dab)侧链与细菌表面带负电荷的脂质 A 上的磷酸基团相互作用。此外,已有研究证明缺乏脂肪酰基尾的 N末端 Thr2-Dab3二肽基序的多粘菌素 B 九肽(PMBN)无法行使抗菌机制。因此,,

多粘菌素,氧化应激,羟自由基,机制


图 1-2 氧化应激诱导多粘菌素产生羟自由基的死亡机制[30, 35]Figure1-2. Death mechanism of polymyxin induced by oxidative stress to phydroxyl radicals[30, 35].菌素通过细胞膜后,刺激三羧酸循环以加速 NADH 的产生,并且通过电2-的产生。O2-攻击铁-硫簇以释放 Fe2+。O2-通过 SOD 转化为 H2O2。在芬2-和 Fe2+转化为 OH 和 Fe3+。细胞内 OH、O2-和 H2O2对 DNA,脂质和蛋白损害最终导致细胞死亡。细胞呼吸的副产物,超氧化物,过氧化氢和羟基自由基可统称为 R细胞毒性。但因细胞内不存在可以解毒羟基自由基的酶,所以羟基的氧化毒害作用比超氧化物和过氧化氢的作用尖锐[27]。这种过胞的氧化杀伤机制可以增加我们对多粘菌素作用于革兰氏阳性菌一步认识。菌素对 Exportal 的破坏Alberto Vega 等人研究发现,在亚致死浓度下,多粘菌素 B 可以优
【学位授予单位】:浙江工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:Q93

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘晓燕;王玲玲;刘振华;;渔用枯草芽孢杆菌发酵工艺优化研究[J];黑龙江畜牧兽医;2019年02期

2 张学科;;刍议枯草芽孢杆菌在动物饲料中的应用[J];畜牧兽医科技信息;2019年06期

3 黄潇航;陈志;陈欢;李元凯;;枯草芽孢杆菌在养殖业中的应用及展望[J];畜牧兽医科技信息;2017年12期

4 侯亚玲;周蓓蓓;王全九;;枯草芽孢杆菌对盐碱土面蒸发及水盐分布的影响[J];水土保持学报;2018年02期

5 王贵斌;马金彩;杨红芬;张轴;徐得云;杨晓龙;吴毅歆;何月秋;;枯草芽孢杆菌结合3506-2基质使用防治甘蓝根肿病药效试验初报[J];农药科学与管理;2017年04期

6 邹艳;;枯草芽孢杆菌在饲料中的研究与应用[J];饲料广角;2017年07期

7 杨荣芳;;饲用枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用[J];黑龙江畜牧兽医;2015年23期

8 李红;赵冰梅;李贤超;;枯草芽孢杆菌防治棉花黄萎病试验示范效果初报[J];农药科学与管理;2016年04期

9 毛涛;袁科平;韦扬帆;;固定化枯草芽孢杆菌净化池塘养殖水体的效果[J];江苏农业学报;2014年06期

10 郝生宏;;饲用枯草芽孢杆菌在畜禽健康养殖业中的应用进展[J];黑龙江畜牧兽医;2015年18期

相关会议论文 前10条

1 亓雪晨;齐俊生;王琦;梅汝鸿;;枯草芽孢杆菌启动子片段的克隆及其在绿色荧光蛋白标记中的应用[A];中国植物病理学会2006年学术年会论文集[C];2006年

2 白海;董润宇;赵轲;陈利东;;3种不同多糖对枯草芽孢杆菌增殖情况的影响[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第五届第十三次全国学术研讨会论文集[C];2018年

3 徐杨;王楠;胡江春;刘丽;潘华奇;王书锦;;海洋枯草芽孢杆菌3512A抗真菌脂肽的特性及其分离[A];微生物实用技术生态环境应用学术研讨会论文集[C];2008年

4 徐琳琳;高洁;;生防菌枯草芽孢杆菌的分离鉴定和抑菌谱测定[A];公共植保与绿色防控[C];2010年

5 张丽霞;李荣禧;王琦;梅汝鸿;;枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化[A];中国植物病理学会2005年学术年会暨植物病理学报创刊50周年纪念会论文摘要集[C];2005年

6 刘国栋;王宝维;黄燕萍;葛文华;张名爱;岳斌;孔敏;魏笑笑;;枯草芽孢杆菌铜与无机铜补铜效果对比试验研究[A];中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学术研讨会论文集[C];2018年

7 郑伟萍;何剑斌;李鹏;龙淼;张彤;陈帅;姜丽莹;杨淑华;;牛阴道分泌物中枯草芽孢杆菌的分离鉴定及抑菌效果的研究[A];中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第十三次学术研讨会论文集[C];2016年

8 申育萌;杨倩;;枯草芽孢杆菌芽孢对猪扁桃体内树突状细胞的影响[A];中国畜牧兽医学会动物解剖及组织胚胎学分会第十八次学术研讨会论文集[C];2014年

9 陈飞洋;崔志英;刘晓琳;李鸿鑫;毕英佐;谢青梅;;枯草芽孢杆菌发酵产物对黄羽肉鸡肠道菌群及免疫功能影响的研究[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第五届第十二次全国学术研讨会论文集[C];2016年

10 张丽霞;李荣禧;王琦;梅汝鸿;;枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化[A];中国植物病理学会2005年学术年会暨植物病理学报创刊50周年纪念会论文集[C];2005年

相关重要报纸文章 前10条

1 王立明;枯草芽孢杆菌的主要作用与功效(下)[N];山东科技报;2019年

2 郑立;枯草芽孢杆菌——植物生长好“保镖”[N];山东科技报;2017年

3 刘基伟 蔚县农牧局;注意正确使用枯草芽孢杆菌[N];河北科技报;2015年

4 中国水产科学研究院;一种枯草芽孢杆菌制剂的发酵生产方法将有效降低成本[N];中国渔业报;2014年

5 ;浅谈枯草芽孢杆菌在水产养殖上的应用[N];中国海洋报;2003年

6 本报记者 胡元珏 江华;将好产品做精做细[N];农资导报;2016年

7 本报记者 沈春蕾;小菌株酝酿大产业[N];中国科学报;2017年

8 ;蛋白酶[N];中国畜牧兽医报;2008年

9 本报记者 苑捷 通讯员 雷丹丹 史亮;助农增收“耍”上新科技[N];大同日报;2019年

10 本报记者 王永钦;“搞科研不像你想象的那样乏味”[N];中国妇女报;2008年

相关博士学位论文 前10条

1 谷翰杰;深海热液一株枯草芽孢杆菌和一种抗脂多糖因子的鉴定与分析[D];中国科学院大学(中国科学院海洋研究所);2019年

2 郭军蕊;枯草芽孢杆菌对蛋鸡益生作用机制的研究[D];中国农业科学院;2017年

3 李杨;基因组简化枯草芽孢杆菌的构建及应用[D];天津大学;2017年

4 郭梦娇;枯草芽孢杆菌的筛选及其诱导兔抗大肠杆菌感染先天性免疫应答机制研究[D];山东农业大学;2018年

5 恩和道力格尔(Enkhdolgor);饲喂酵母和枯草芽孢杆菌对奶牛产奶性能、免疫和抗氧化能力及氮排放的影响[D];内蒙古农业大学;2017年

6 张煜;新型枯草芽孢杆菌的研发及其发酵饲料在仔猪上的应用研究[D];浙江大学;2017年

7 朱沛霁;枯草芽孢杆菌对雪山鸡生产性能、肠道健康和免疫机能的影响及机制[D];扬州大学;2017年

8 张清霞;甘露寡糖诱导抗病反应初步研究及枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶基因的克隆与表达[D];中国农业大学;2005年

9 李晓静;枯草芽孢杆菌核黄素操纵子及呼吸链的代谢工程改造[D];天津大学;2006年

10 刘永锋;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs-916胞外抗菌蛋白质的纯化及其鉴定[D];南京农业大学;2006年

相关硕士学位论文 前10条

1 李琼燕;枯草芽孢杆菌的分离鉴定及对沙门氏菌的保护性实验研究[D];吉林农业大学;2019年

2 尹施淇;枯草芽孢杆菌对盆栽辣椒土壤特性及生长影响的研究[D];吉林农业大学;2019年

3 吴开年;枯草芽孢杆菌glnA和glnR基因的鉴定及其对氨氮的应答[D];西南民族大学;2019年

4 傅佳女;枯草芽孢杆菌中dlt操纵子对多粘菌素E抗性的影响机制研究[D];浙江工业大学;2019年

5 王玉建;枯草芽孢杆菌表达产气荚膜梭菌α,β和ε毒素融合蛋白对小鼠的免疫保护作用[D];山东农业大学;2019年

6 程媛;枯草芽孢杆菌启动子片段的克隆及分子改造[D];广西大学;2019年

7 蒋蕊;α-淀粉酶共表达系统的研究及在枯草芽孢杆菌中最优信号肽的筛选[D];云南师范大学;2019年

8 李琳;Ag-TiO_2/MOFs复合材料的制备及其性能研究[D];长春理工大学;2019年

9 许超;枯草芽孢杆菌BIB-9的产芽孢条件优化及其对番茄生长的影响[D];山东农业大学;2019年

10 闫杨;生防芽孢杆菌B579微生态效应研究及菌剂制备[D];聊城大学;2019年



本文编号:2646907

资料下载
论文发表

本文链接:https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2646907.html


Copyright(c)文论论文网All Rights Reserved | 网站地图 |

版权申明:资料由用户71d15***提供,本站仅收录摘要或目录,作者需要删除请E-mail邮箱bigeng88@qq.com