拟南芥硝态氮调控基因T5120和NSIG的克隆与功能鉴定

发布时间：2020-05-04 21:52

【摘要】：氮素是植物生长发育所需的最主要的大量元素之一,氮肥的施用是维持作物高产稳产的关键。农业上施加大量的氮肥以提高作物的产量,但由于作物对氮肥的吸收利用率低,使得未被植物吸收利用的氮素流失到环境中,造成了严重的面源污染。因此,必须加强对植物吸收利用氮素的分子规律和调控网络的研究,以提高作物的氮素利用率、推动农业的可持续发展。但由于植物体内调控氮素吸收利用的机制十分精细复杂,使得对氮素调控的研究进展十分缓慢。本研究利用RNA-seq技术检测到强烈响应NO_3~-的lncRNA T5120,同时还利用正向遗传学的方法克隆出1个NO_3~-负调控基因NSIG,并对它们在NO_3~-信号及代谢调控方面的功能进行了深入、系统的分析。一、LncRNA T5120调控NO_3~-信号及同化利用长链非编码RNA在各个生物学进程中都发挥重要的调控作用,但目前还未有其在硝态氮调控方面的报道。我们利用RNA-seq测序技术检测受NO_3~-处理影响的lncRNAs,结合qPCR技术的验证结果,鉴定出六个受NO_3~-强烈诱导的lncRNAs,其中T5120的NO_3~-诱导量最高;进一步的研究发现T5120的表达在硝态氮还原酶(NR-null)突变体中仍受NO_3~-的诱导,说明T5120的表达可以直接受NO_3~-信号的诱导,而不是NO_3~-的还原产物。qPCR检测发现T5120过表达系中NO_3~-响应基因的NO_3~-诱导量明显升高,表明T5120能调控植物对NO_3~-的响应;生理检测发现T5120过表达系的NO_3~-含量显著降低;进一步的研究结果显示,过表达系的硝态氮还原酶(NR)活性和氨基酸含量明显升高,而对NO_3~-的吸收不变,说明过表达系中NO_3~-含量降低是由于同化作用增强造成的。分子水平的检测结果表明,T5120过表达系中部分NO_3~-同化基因的表达量显著增加。上述结果说明T5120能促进植物对NO_3~-的初级响应和同化利用。为进一步了解T5120的作用机制,我们分析了T5120的启动子序列,发现其启动子区存在一个NO_3~-响应(NRE-like)元件;随后利用Y1H和ChIP-qPCR技术进行鉴定,结果显示NLP7可以结合T5120的启动子,LUC/REN双荧光素酶报告系统分析表明NLP7可以激活T5120的转录,进一步的研究发现NLP7可以调控T5120的表达和NO_3~-诱导量,这些结果说明NLP7可以直接结合T5120并调控其表达。将T5120在nlp7-4突变体中过表达,发现T5120/nlp7-4株系根部的荧光明显强于nlp7-4突变体;T5120/nlp7-4株系的NR活性和NO_3~-同化基因的表达明显升高,表明T5120能部分恢复nlp7突变体在NO_3~-信号及同化方面的缺陷。上述结果说明T5120作用于NLP7的下游调控NO_3~-信号。通过对T5120过表达系在低和高两种NO_3~-浓度条件下的表型观察及统计,发现T5120能促进植物的生长。二、NSIG调控NO_3~-信号及代谢正向遗传学是克隆新基因的有效途径,本研究还利用NO_3~-调控基因筛选系统克隆出一个新基因NSIG。在无NO_3~-的培养条件下,含NO_3~-响应启动子(NRP-YFP)的野生型幼苗根部不发荧光,通过筛选突变群体,筛选出一个根部发强荧光的NO_3~-负调控突变体E7;通过图位克隆和全基因组测序确定突变基因为一个新的NO_3~-调控基因,将其命名为NSIG(NITRATE SIGNALING INHIBITED GENE),原生质体瞬时转化实验表明该蛋白定位于细胞核中。RNA-seq分析显示E7突变体中多个NO_3~-响应基因的表达显著高于野生型,说明NSIG负调控NO_3~-信号;进一步的研究发现,有NO_3~-存在下,NSIG依然负调控NO_3~-信号,说明NSIG对NO_3~-信号的负调控作用不依赖于NO_3~-。为研究NSIG在NO_3~-代谢方面的功能,我们检测了E7突变体中的NO_3~-含量,发现突变体中NO_3~-含量降低;深入的研究发现E7突变体对NO_3~-的吸收降低,而NR活性和氨基酸含量升高,分子水平的检测发现E7突变体中转运基因NRT1.1的表达下降,而部分NO_3~-同化基因的表达升高。这些结果说明NSIG调控了植物对NO_3~-的吸收和同化。为研究NSIG与NRT1.1的作用关系,我们分别检测了单基因突变体中另一基因的表达,发现E7突变体中NRT1.1的表达显著降低,而nrt1.1突变体中NSIG的表达没有变化;接下来我们构建了E7 chl1-13的双突变体,并对其荧光进行了观察,发现NSIG与NRT1.1在不同通路上调控NO_3~-的信号。上述结果表明NSIG可以调控NRT1.1的转运功能,但不影响其信号功能。通过对NSIG与NLP7作用关系的研究,发现NSIG与NLP7在NO_3~-信号调控途径中也是相互独立的。本研究克隆了两个新的NO_3~-调控基因T5120和NSIG、鉴定了它们在NO_3~-调控方面的功能、阐明了它们的作用机制,为解析植物体内的NO_3~-调控机制和网络奠定了基础、为提高作物的氮素利用率提供了理论依据和指导。
【图文】：

生理功能,拟南芥,家族,蛋白

图 1-1 拟南芥 NRT1 和 NRT2 转运蛋白的生理功能（Wang et al., 2018）-1 Physiological functions of NRT1 and NRT2 proteins in Arabidopsis (Wang et alC 转运蛋白家族蛋白是氯离子通道蛋白，目前，已在拟南芥中鉴定出 7 个 CLC 家族定位于液泡膜上，是 NO3-和质子反向运输的蛋白。与野生型相比，积累量显著减低，表明 CLCa 参与液泡中 NO3-积累的过程（Angeli et外，其它 CLC 家族成员的功能还未见报道。研究发现 CLCb、CLCc定位于液泡膜上，CLCe 定位于叶绿体中，而 CLCd 和 CLCf 定位于 Fecht-Bartenbach et al., 2010）。AC/SLAH 转运蛋白家族C/SLAH 转运蛋白家族是慢性阴离子通道蛋白，主要在气孔保卫细胞芥中已鉴定出 5 个 SLAC/SLAH 家族成员，分别是 SLAC1 和 SLAH

过程图,过程,谷氨酰胺,叶绿体

需被同化为有机物后才可被植物吸收利用。NO3在硝酸还原酶（NR）的作用下被还原为 NO2-，该还原过程在细胞质中完成。拟南芥中有 2 个编码 NR 酶的基因，分别是 NIA1和 NIA2，它们的表达受 NO3-的诱导，且 NR 酶的活性受光照、供氧量、PH 等环境因素的影响（Cookson et al., 2005; Jonassen et al., 2009）。NO2-的积累对植物有毒害作用，，需在亚硝酸还原酶（NIR）的作用下还原为 NH4+，该过程既可以在根的质体，也可以在叶的叶绿体中完成。图 1-2 为 NO3-在叶和根中被还原为 NH4+的过程（孟庆伟等，2017）。质体或叶绿体中的NH4+在谷氨酰胺合成酶的作用下合成谷氨酰胺，植物中有GS1和GS2两种谷氨酰胺合成酶。其中 GS1 有多个同源基因编码，分别是 GLN1.1、GLN1.2、GLN1.3、GLN1.4，且主要在无法进行光合作用的细胞中发挥功能；而 GS2 是由单基因编码的，主要在叶绿体中发挥功能，还可将光呼吸过程产生的 NH4+转化为谷氨酰胺（Wallsgroveet al., 1987; Cren & Hirel, 1999; Tabuchi et al., 2005）。谷氨酰胺可在谷氨酸合酶的作用下转化为谷氨酸，而谷氨酸可作为前体用于合成其它氨基酸和酰胺被植物利用（吴巍和赵军，2010）。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2

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