明党参内生菌的分离鉴定及生物学特性研究

发布时间：2020-05-10 12:08

【摘要】：明党参是我国伞形科的单种属珍稀植物,属于国家三级重点保护植物。本文旨在对珍稀中草药明党参的微生物种群基因库进行探索,发掘明党参微生物种群的生物功能,筛选出可拮抗致病菌的内生菌株,以及能高效降解广泛使用的磺酰脲类除草剂——苯磺隆的降解菌,并研究明党参内生菌对其三种呋喃香豆素成分的生物转化作用。研究结果表明:(1)本实验经三步消毒法和平板培养法,从新鲜的明党参植株的根、茎、叶中分离筛选出29株内生细菌和18株内生真菌。在不同组织中明党参植株的内生菌株数量存在一定的差异,菌株数量根中最多,茎中最少。经过培养特征、形态学鉴定、生化特性、16S r DNA基因序列分析、遗传图谱分析和全自动微生物质谱检测等手段,发现内生细菌中芽孢杆菌属居多。(2)利用混菌法,经过试验的初筛,明党参内生细菌有5株菌对金黄色葡萄球菌表现出较好的抑菌性。通过复筛,其中菌株NMG5对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径可达28.5mm,菌株NMJ10的抑菌圈直径值为20.30mm,表明其具有相对较强的抑菌作用,且菌株NMJ10具有广谱抑菌作用。根据生物学鉴定,菌株NMJ10为芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.NMJ10),菌株NMG5为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa NMG5)。(3)为了解决苯磺隆的残留问题,本实验筛选出能够高效降解苯磺隆的菌株,以期制成降解率更高的复合菌剂。采用富集驯化培养分离法,筛出多株能降解苯磺隆的菌株,通过复筛得到菌株PMG3和NMY4能够高效降解磺酰脲类除草剂苯磺隆。经过菌株降解之后,第1天时降解效率最高,在第三天时降解率可以达到89%以上。其中经过3天降解,菌株PMG3降解苯磺隆的降解率可以达到89.01%-90.39%,菌株NMY4的降解率为88.97%-89.13%。根据生物学鉴定,菌株PMG3为芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.PMG3)。(4)为了探究明党参内生菌对其三种呋喃香豆素成分的生物转化作用,本文通过HPLC法测定明党参原粉培养液经明党参内生菌发酵后欧前胡素、异欧前胡素、补骨脂素三种呋喃香豆素成分的含量。随着菌株转化,明党参原液经明党参内生菌发酵后,提高了呋喃香豆素成分欧前胡素、异欧前胡素和补骨脂素的含量,代谢产物主要集中在发酵液的上清液中。明党参培养液的发酵过程中,经菌株NMG10发酵后,欧前胡素、异欧前胡素和补骨脂素的增加比例依次为97.72%、2.38%和4.62%,相对的呋喃香豆素总量增加39.60%。通过一系列实验,可以看出菌株NMG10对三种呋喃香豆素类成分的转化作用最佳,菌株在整个发酵过程中对欧前胡素这一成分的含量有显著的提高作用,可证明更有利于欧前胡素成分的转化合成。根据生物学鉴定,菌株NMG10为假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)。
【图文】：

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2 明党参内生菌的分离纯化与鉴定94℃ 4min 预变性94℃ 45 sec55 ℃ 45 sec30 cycle72℃ 1 min72℃ 10 min 修复延伸4℃ ∞ 终止反应2.3 凝胶电泳 1%琼脂糖下电泳，，设置 150 V ，100 mA ，20 min 电泳观察。表 2.11 PCR 循环条件Tab2.11 PCR cycle conditions温度时间程序

菌落形态,明党参,菌落形态

图 2.3.1 明党参各组织内生细菌的形态Figure 2.3.1 Morphology of endophytic bacteria in various tissues of Changium smyrnioidesWolff（注：A 明党参根组织的菌落形态 B 明党参茎组织的菌落形态 C 明党参叶组织切块的菌落形态）表 2.3.1 明党参内生细菌编号及菌落形态学观察Table 2.3.1 The numbering of endogenous bacteria of Changium smyrnioides Wolff andmorphological observation of the colony菌株编号菌落形态颜色大小形状边缘状况干燥或湿润来源NMG3 绿色微小圆形整齐湿润根NMG5 绿色小不规则不整齐湿润根NMG6 黄绿色微小圆形整齐湿润根
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.53;Q93

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