HepG2和293T细胞内敲除LMNA基因对细胞形态和生物学功能的影响

发布时间：2020-05-09 23:24

【摘要】：第一章利用CRISPR/Cas9技术在HepG2和293T细胞内敲除LMNA基因目的:利用CRISPR/Cas9技术对体外培养的293T与HepG2细胞株的LMNA(Lamin A,A型核纤层蛋白)基因进行编辑,获得LMNA基因敲除细胞系,并观察细胞核膜变化以及整体细胞形态的变化。方法:利用CRISPR/Cas9系统对293T细胞以及HepG2细胞的LMNA基因进行编辑,然后进行嘌呤霉素筛选,单克隆挑取,DNA测序和western blot鉴定,对获取的LMNA双等位基因敲除细胞克隆进行扩增与保存。利用扫描电镜和透射电镜对LMNA敲除(LMNA KO)以及野生型(WT)细胞的形态与核膜形态进行观察,同时利用免疫荧光技术对LMNA敲除细胞核膜与细胞骨架进行观察。结果:DNA测序结果显示293T与HepG2单克隆细胞均有碱基缺失,蛋白免疫印迹结果显示Lamin A/C不表达,成功获得两株LMNA基因敲除细胞。光学显微镜下发现后,293T细胞的LMNA基因敲除后,与野生型比较其胞体变小变圆,突出连接减少并变细;HepG2细胞的LMNA基因敲除后,与野生型比较其细胞变成多边形,胞质较为均匀的分布在核周。透射电镜发现LMNA基因敲除后,细胞核膜失去光滑,变得凹凸不平。结论:Lamin A/C的缺失会导致体外培养细胞的核膜变形,进一步导致整个细胞形态的改变。第二章敲除LMNA基因对HepG2和293T细胞增殖、迁移、克隆形成能力与体内致瘤性的影响目的:比较293T与HepG2细胞LMNA基因敲除细胞株(LMNA KO)和野生型细胞系(WT)的细胞增殖、迁移、克隆形成能力以及体外与体内的致瘤性,研究LMNA基因缺失对细胞生物学特性的影响,并探索相关分子机制。方法:1)将293T与HepG2细胞分为WT组和LMNA KO组,利用CCK-8法检测细胞的增殖能力,利用流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期。LMNA KO细胞内过表达LMNA,Western blot检测细胞周期相关蛋白CDK1与Cyclin B1,DNA损伤标志物γ-H2A.X,抑癌基因RB和P16的表达量以及组蛋白表观遗传修饰情况(H3K9me3、H3K27me3)。2)通过细胞划痕和transwell实验对WT与LMNA KO细胞的迁移与穿孔能力进行检测,并通过western blot检测MMP2,MMP9,COL1A1与integrinβ4的表达量。3)软琼脂克隆形成实验:6孔板每孔每种加入3000个细胞,4周后测量克隆体直径与数量;平板克隆形成实验:六孔板每孔加入1000细胞,2周后计数克隆体数量。4)裸鼠体内致瘤性实验:将24只4周龄雌性裸鼠随机分为4组(n=6),分别注射293T,HepG2,293T-LMNA KO与HepG2-LMNA KO四种细胞(每只裸鼠前肢两侧腋下各注射2x10~6细胞量),经过一周之后每3天测量肿瘤直径,3周后颈椎脱臼处死小鼠,剥离瘤块测量体积与重量。结果:1)293T-LMNA KO较293T-WT增殖能力下降(P0.05),细胞凋亡率上升(P0.05);293T-LMNA KO细胞出现G2/M期阻滞,Cyclin B1,CDK4/6,H3K27me3,H3K9me3没明显变化,CDK1下降(P0.05),γH2A.X表达上升(P0.05),P16表达上升(P0.05);HepG2-LMNA KO较HepG2-WT增殖能力显著下降(P0.01),细胞凋亡率上升(P0.05);HepG2-LMNA KO细胞出现G2/M期阻滞,Cyclin B1,CDK4/6,H3K27me3,H3K9me3表达量没显著变化,CDK1下降(P0.05),γH2A.X表达上升(P0.05),P16表达上升(P0.05)。2)划痕实验结果显示293T-LMNA KO较293T-WT细胞水平迁移能力显著下降(P0.001),HepG2-LMNA KO较HepG2-WT细胞水平迁移能力显著下降(P0.001)。transwell实验结果显示293T-LMNA KO细胞侵袭能力增强(P0.05),HepG2-LMNA KO侵袭能力增强,两种敲除细胞MMP2表达量升高,integrinβ4表达量升高(P0.01)。3)软琼脂培养实验结果显示293T-LMNA KO较293T-WT克隆数量下降(P0.05),克隆体直径减少(P0.05),平板克隆实验结果显示293T-LMNA KO克隆数量减少(P0.05),裸鼠体内成瘤实验结果显示293T-LMNA KO瘤块体积与质量均下降(P0.05);软琼脂培养实验结果显示HepG2-LMNA KO较HepG2-WT克隆数量下降(P0.05),克隆体直径减少(P0.05),平板克隆实验结果显示HepG2-LMNA KO克隆数量减少(P0.05),裸鼠体内成瘤实验结果显示HepG2-LMNA KO瘤块体积减少(P0.05)质量下降(P0.01)。结论:两株LMNA KO细胞增殖能力下降,迁移能力下降,软琼脂克隆形成能力下降,且裸鼠体内成瘤能力也显著下降,但细胞侵袭能力升高;两株LMNA KO存在G2/M期阻滞,P16的表达上升,且CDK1的表达下降。
【图文】：

经过含有氨苄霉PCR 对重组质粒进行初步挑选（图gRNA 与 PX459 成功连接（图1-1 PX458-LMNAgRNA 重组质粒的构建1 PX458-LMNAgRNArecombinant plasmid320bp。 B：重组质粒的 DNA 测序显示所设计合成的PX-459-gRNA3和PX-459PX-459-gRNA1 和 PX-459-gRNA296 孔板开始单克隆挑选。挑纯之后提取单克隆两侧 400bp 左右序列，测序结果显示在的 LMNA 两个等位基因（1-2A）。然后我们利用LMNA等位都缺失若干碱基（图293T 单克隆细胞株在2019届硕士学位论文1-1A）。1-1B）。LMNAgRNArecombinant4 条459-gRNA4重组gRNA2 重组质粒。利gRNA 附1-2B）。

HepG2和293T细胞内敲除LMNA基因对细胞形态和生物学功能的影响LMNA 敲除细胞。5 RNA-seq 差异表达基因的根据 RNA-seq 结果，我们对部分差异表达基因进行了现与 RNA-seq 结果一致，，降，MMP2 表达升高，但蛋白免疫印迹结果显示1-5A,B）。WB 验证western blotLMNAKO 型细胞较于野生型细胞P15 却没有明显变化（图2019届硕士学位论文验证，发CDK1 表达下
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 A.Ben—Zeév;汪X仁;;肿瘤细胞内的细胞骨架[J];细胞生物学杂志;1987年03期

2 A.Ben-Ze'ev;汪X仁;;肿瘤细胞内的细胞骨架(续)[J];细胞生物学杂志;1987年04期

3 陈卫三,姚开泰;Hela细胞的热疗动力学研究[J];湖南医学院学报;1988年02期

4 黄涛生;董燕麟;;细胞的生长与癌变[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;1988年05期

5 王琦,张丕方;斑叶海棠薄层培养中细胞无丝分裂及2,4-D的特殊效应的研究[J];西北植物学报;1989年01期

6 杨立英;;细胞骨架研究 数据聚焦分析[J];科学观察;2007年05期

7 陈吉龙，王平;淋巴细胞骨架的研究[J];动物学杂志;1994年05期

8 周青山;丁明孝;王晓;陈利华;翟中和;门绍杰;徐伟;;应用电镜研究病毒与细胞骨架关系的几种简单方法[J];电子显微学报;1986年02期

9 刘娅利;陈晓明;;细胞骨架作用剂抗青光眼的研究进展[J];眼科研究;2007年03期

10 赵泳根;;《细胞骨架》[J];生命科学;1993年05期

相关会议论文 前10条

1 徐光魁;;细胞骨架力学[A];第十二届全国生物力学学术会议暨第十四届全国生物流变学学术会议会议论文摘要汇编[C];2018年

2 赵红斌;张西正;吴金辉;郭勇;毛艳;;不同应变对骨髓间充质干细胞系细胞骨架影响的研究[A];天津市生物医学工程学会2006年学术年会论文摘要集[C];2006年

3 徐光魁;冯西桥;王刚锋;;细胞骨架力学的几个问题[A];2018年全国固体力学学术会议摘要集（上）[C];2018年

4 訾晓渊;;《细胞骨架》讲课评比 授课内容:细胞骨架-概述[A];中国细胞生物学学会第十届全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文集[C];2011年

5 张晓光;惠延年;韩泉洪;侯旭;黄晓峰;马吉献;;结合磁珠与否机械牵拉模型下培养人RPE细胞牵拉模型中细胞骨架的变化[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

6 徐进;;细胞骨架相关的微囊藻毒素毒性机理研究[A];浙江省毒理学会第二届学术年会论文集[C];2015年

7 王伯初;杨兴艳;时兰春;;共聚焦显微镜下单细胞可控机械力加载方法的研究[A];第十届全国生物力学学术会议暨第十二届全国生物流变学学术会议论文摘要汇编[C];2012年

8 高霞;徐虹;刘海梅;饶佳;查锡良;;血管生成素样蛋白3对足细胞骨架重排影响的可能信号通路分析[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2010年

9 郑楷;王一飞;;细胞骨架调控蛋白LASP-1在单纯疱疹病毒感染中的作用[A];广东省生物物理学会2013年学术研讨会论文集[C];2013年

10 叶秀麟;徐是雄;王凌健;;利用GFP基因研究细胞骨架在植物活体细胞的新进展[A];中国植物学会七十周年年会论文摘要汇编（1933—2003）[C];2003年

相关博士学位论文 前10条

1 付琛颖;EWI-2对肿瘤细胞运动性、粘附性以及间叶样细胞向阿米巴样细胞转换的影响[D];南方医科大学;2013年

2 耿锋;Mdig调控非小细胞肺癌转移和增殖的分子机制研究[D];中国医科大学;2018年

3 庄昊;GLDC调控cofilin泛素化影响肝细胞癌转移及预后[D];天津医科大学;2018年

4 赵焱钢;ERα在雌激素调节海马actin细胞骨架重塑与学习记忆中作用与机制的初步研究[D];第三军医大学;2017年

5 王喜明;MicroRNA-145靶向Racl加重H9c2细胞缺氧损伤机制的研究[D];郑州大学;2018年

6 王春杨;人前列腺癌相关基因UROC28功能的初步研究[D];第四军医大学;2004年

7 何建英;hNaDC3对肾小管上皮细胞能量代谢和凋亡的影响以及AngⅡ的调控作用[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年

8 杨国嵘;体内外HCMV感染对宿主细胞表型的影响及其机制[D];第四军医大学;2004年

9 周建平;MIN6细胞分泌过程的形态学研究[D];中国医科大学;2004年

10 刘洪瑞;滨蒿内酯抗肿瘤作用及机制的研究[D];中国医科大学;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 刘恒;HepG2和293T细胞内敲除LMNA基因对细胞形态和生物学功能的影响[D];广西医科大学;2019年

2 王舒;A_2E在蓝光照射人RPE细胞过程中对Ca~(2+)-PKC信号通路的影响[D];遵义医科大学;2019年

3 任亚南;HSP70在TGF-β诱导A549细胞EMT进程中的作用[D];郑州大学;2019年

4 蔡先志;拟南芥中ROP信号调控花瓣锥形细胞形态建成的初步研究[D];福建农林大学;2018年

5 庄睿娟;冷休克蛋白RBM3对鱼藤酮诱导的PD细胞模型的保护作用及机制研究[D];新乡医学院;2018年

6 于丽光;谷氨酰胺和谷氨酸对小鼠成纤维细胞和人宫颈腺癌细胞差异代谢产物的研究[D];江南大学;2018年

7 李娜;艾司西酞普兰对MPTP处理的PC12细胞的保护作用及机制[D];河北医科大学;2018年

8 白艳林;Abl激酶抑制剂STI-571可通过PTEN-PI3K/AKT信号途径影响A375细胞的增殖和凋亡[D];吉林大学;2018年

9 苏雷;STGC3高表达对CNE2细胞放疗敏感性的影响[D];南华大学;2018年

10 王依;NHE1通过p38MAPK信号通路调节人肺癌A549细胞的侵袭转移及其机制[D];广东药科大学;2018年

本文编号：2656901