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HepG2和293T细胞内敲除LMNA基因对细胞形态和生物学功能的影响

发布时间:2020-05-09 23:24
【摘要】:第一章利用CRISPR/Cas9技术在HepG2和293T细胞内敲除LMNA基因目的:利用CRISPR/Cas9技术对体外培养的293T与HepG2细胞株的LMNA(Lamin A,A型核纤层蛋白)基因进行编辑,获得LMNA基因敲除细胞系,并观察细胞核膜变化以及整体细胞形态的变化。方法:利用CRISPR/Cas9系统对293T细胞以及HepG2细胞的LMNA基因进行编辑,然后进行嘌呤霉素筛选,单克隆挑取,DNA测序和western blot鉴定,对获取的LMNA双等位基因敲除细胞克隆进行扩增与保存。利用扫描电镜和透射电镜对LMNA敲除(LMNA KO)以及野生型(WT)细胞的形态与核膜形态进行观察,同时利用免疫荧光技术对LMNA敲除细胞核膜与细胞骨架进行观察。结果:DNA测序结果显示293T与HepG2单克隆细胞均有碱基缺失,蛋白免疫印迹结果显示Lamin A/C不表达,成功获得两株LMNA基因敲除细胞。光学显微镜下发现后,293T细胞的LMNA基因敲除后,与野生型比较其胞体变小变圆,突出连接减少并变细;HepG2细胞的LMNA基因敲除后,与野生型比较其细胞变成多边形,胞质较为均匀的分布在核周。透射电镜发现LMNA基因敲除后,细胞核膜失去光滑,变得凹凸不平。结论:Lamin A/C的缺失会导致体外培养细胞的核膜变形,进一步导致整个细胞形态的改变。第二章敲除LMNA基因对HepG2和293T细胞增殖、迁移、克隆形成能力与体内致瘤性的影响目的:比较293T与HepG2细胞LMNA基因敲除细胞株(LMNA KO)和野生型细胞系(WT)的细胞增殖、迁移、克隆形成能力以及体外与体内的致瘤性,研究LMNA基因缺失对细胞生物学特性的影响,并探索相关分子机制。方法:1)将293T与HepG2细胞分为WT组和LMNA KO组,利用CCK-8法检测细胞的增殖能力,利用流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期。LMNA KO细胞内过表达LMNA,Western blot检测细胞周期相关蛋白CDK1与Cyclin B1,DNA损伤标志物γ-H2A.X,抑癌基因RB和P16的表达量以及组蛋白表观遗传修饰情况(H3K9me3、H3K27me3)。2)通过细胞划痕和transwell实验对WT与LMNA KO细胞的迁移与穿孔能力进行检测,并通过western blot检测MMP2,MMP9,COL1A1与integrinβ4的表达量。3)软琼脂克隆形成实验:6孔板每孔每种加入3000个细胞,4周后测量克隆体直径与数量;平板克隆形成实验:六孔板每孔加入1000细胞,2周后计数克隆体数量。4)裸鼠体内致瘤性实验:将24只4周龄雌性裸鼠随机分为4组(n=6),分别注射293T,HepG2,293T-LMNA KO与HepG2-LMNA KO四种细胞(每只裸鼠前肢两侧腋下各注射2x10~6细胞量),经过一周之后每3天测量肿瘤直径,3周后颈椎脱臼处死小鼠,剥离瘤块测量体积与重量。结果:1)293T-LMNA KO较293T-WT增殖能力下降(P0.05),细胞凋亡率上升(P0.05);293T-LMNA KO细胞出现G2/M期阻滞,Cyclin B1,CDK4/6,H3K27me3,H3K9me3没明显变化,CDK1下降(P0.05),γH2A.X表达上升(P0.05),P16表达上升(P0.05);HepG2-LMNA KO较HepG2-WT增殖能力显著下降(P0.01),细胞凋亡率上升(P0.05);HepG2-LMNA KO细胞出现G2/M期阻滞,Cyclin B1,CDK4/6,H3K27me3,H3K9me3表达量没显著变化,CDK1下降(P0.05),γH2A.X表达上升(P0.05),P16表达上升(P0.05)。2)划痕实验结果显示293T-LMNA KO较293T-WT细胞水平迁移能力显著下降(P0.001),HepG2-LMNA KO较HepG2-WT细胞水平迁移能力显著下降(P0.001)。transwell实验结果显示293T-LMNA KO细胞侵袭能力增强(P0.05),HepG2-LMNA KO侵袭能力增强,两种敲除细胞MMP2表达量升高,integrinβ4表达量升高(P0.01)。3)软琼脂培养实验结果显示293T-LMNA KO较293T-WT克隆数量下降(P0.05),克隆体直径减少(P0.05),平板克隆实验结果显示293T-LMNA KO克隆数量减少(P0.05),裸鼠体内成瘤实验结果显示293T-LMNA KO瘤块体积与质量均下降(P0.05);软琼脂培养实验结果显示HepG2-LMNA KO较HepG2-WT克隆数量下降(P0.05),克隆体直径减少(P0.05),平板克隆实验结果显示HepG2-LMNA KO克隆数量减少(P0.05),裸鼠体内成瘤实验结果显示HepG2-LMNA KO瘤块体积减少(P0.05)质量下降(P0.01)。结论:两株LMNA KO细胞增殖能力下降,迁移能力下降,软琼脂克隆形成能力下降,且裸鼠体内成瘤能力也显著下降,但细胞侵袭能力升高;两株LMNA KO存在G2/M期阻滞,P16的表达上升,且CDK1的表达下降。
【图文】:

序列,菌落PCR,电泳显示,阳性克隆


经过含有氨苄霉PCR 对重组质粒进行初步挑选(图gRNA 与 PX459 成功连接(图1-1 PX458-LMNAgRNA 重组质粒的构建1 PX458-LMNAgRNArecombinant plasmid320bp。 B:重组质粒的 DNA 测序显示所设计合成的PX-459-gRNA3和PX-459PX-459-gRNA1 和 PX-459-gRNA296 孔板开始单克隆挑选。挑纯之后提取单克隆两侧 400bp 左右序列,测序结果显示在的 LMNA 两个等位基因(1-2A)。然后我们利用LMNA等位都缺失若干碱基(图293T 单克隆细胞株在2019届硕士学位论文1-1A)。1-1B)。LMNAgRNArecombinant4 条459-gRNA4重组gRNA2 重组质粒。利gRNA 附1-2B)。

基因敲除,结果分析,差异表达基因,野生型细胞


HepG2和293T细胞内敲除LMNA基因对细胞形态和生物学功能的影响LMNA 敲除细胞。5 RNA-seq 差异表达基因的根据 RNA-seq 结果,我们对部分差异表达基因进行了现与 RNA-seq 结果一致,,降,MMP2 表达升高,但蛋白免疫印迹结果显示1-5A,B)。WB 验证western blotLMNAKO 型细胞较于野生型细胞P15 却没有明显变化(图2019届硕士学位论文验证,发CDK1 表达下
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:Q78

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本文编号:2656901

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