小麦耐逆基因TaCaM1和TaMAPK3分子特征及功能研究

发布时间：2020-05-09 20:34

【摘要】：为了更好地适应多变的外界环境,植物体内进化出了一套抵御外界胁迫的分子机制,包括信号的感知、传导及下游的转录调控、应答反应等。其中钙信号转导途径和促分裂原活化蛋白激酶级联途径对植物应答外界胁迫起到了至关重要的作用。本试验对小麦钙调素基因TaCaM1和促分裂原活化蛋白激酶基因TaMAPK3的分子特征和抗逆特性进行了研究。主要研究结果如下:1、利用生物信息学方法,分析预测了小麦钙调素基因TaCaM1的核苷酸序列及编码的氨基酸序列,并对其进行了系统进化分析、同源氨基酸序列比对、跨膜螺旋域分析、三级结构预测和亚细胞定位预测。结果表明:TaCaM1的核苷酸序列全长为759bp,编码149个氨基酸,不含有跨膜螺旋域,预测的亚细胞定位主要在细胞质,少量位于细胞核。2、利用RT-PCR技术对TaCaM1在不同逆境下的表达特征进行分析,得知TaCaM1在低磷胁迫下表达量减少,在低氮、盐分和干旱胁迫下表达量均略有增加。3、利用DNA重组技术构建了融合TaCaM1的正、反义双元表达载体及融合TaCaM1和TaMAPK3的亚细胞定位表达载体;利用农杆菌介导法对TaCaM1进行烟草和小麦的遗传转化,获得了正、反义转基因烟草植株及超表达该基因的小麦植株。利用注射烟草结合荧光检测的方法对TaCaM1和TaMAPK3表达的蛋白进行亚细胞定位检测,表明TaCaM1定位于细胞质与细胞核,TaMAPK3定位于细胞核。4、利用土培法和水培法对TaCaM1正、反义转基因烟草株系进行了抗逆功能鉴定,发现在低磷胁迫下,与野生型烟草相比,正义系烟草植株生长单薄柔弱,根系短,叶面积小,叶绿素含量低,鲜干重小,反义系烟草植株茂盛健壮,根系长,叶面积大,叶绿素含量高,鲜干重大;而在低氮、盐分和干旱胁迫下,正义系烟草植株较野生型长势茂盛,根系长,叶面积大,叶绿素含量高,鲜干重大;反义系弱小,根系短,叶面积小,叶绿素含量低,鲜干重小。说明TaCaM1基因对低磷、低氮、盐分及干旱逆境具有一定的调控作用。5、结合课题组前期工作,对TaMAPK3转基因系烟草在干旱、盐分及ABA胁迫下的气孔特征进行观察分析,结果表明,在盐分胁迫下,TaMAPK3转基因系烟草较野生型气孔关闭较快,说明高盐逆境下TaMAPK3可能通过调控下游基因功能,快速积累ABA,进而促进气孔关闭,减少蒸腾,抵御渗透胁迫。6、利用高通量测序技术,对低磷逆境处理48h的TaMAPK3转基因系烟草和野生型烟草转录组进行了分析,探究了两者差异基因的GO功能富集及KEGG代谢通路的富集情况。结果表明其差异基因的GO功能主要富集在对伤害的响应及多种代谢酶活性调节;KEGG代谢通路主要富集在异喹啉生物碱生物合成、二苯乙烯、二芳基庚酸和姜醇的生物合成、氨基酸的生物合成、酪氨酸代谢和丙酮酸代谢等方面。表明TaMAPK3可能通过激活相关抗逆基因,调控相应代谢过程,响应低磷逆境。7、利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术进行TaMAPK3互作蛋白的筛选,表明TaMAPK3与TaWRKY46有互作关系。说明TaMAPK3可能通过调控下游WRKY型转录因子基因进而发挥抗逆功能。
【图文】：

提出钙调素的中央螺旋很容易发生扭曲，使两边的球状结构域靠近，这就说明了中央螺旋含有一段具有柔性的非螺旋区，当钙调素与其靶酶结合时，这段非螺旋区可以将中央螺旋伸展开来，方便钙调素与不同大小的靶酶相结合（图1B）[22-23]。钙调素自身没有酶活性，它的主要作用是通过与靶蛋白结合来传递钙信号。植物受到外界环境胁迫的刺激时，植物细胞内的钙离子浓度会发生瞬时变化，进而与钙调素的 EF-hand 结构结合改变其构象，钙调素构象的改变使其结合下游的钙调素结合蛋白传递钙信号，，促进生物反应的进行。并且有研究数据指出，植物在非生物胁迫如低温、水分胁迫等条件下，体内钙调素含量会相对升高。实验还证明钙调素同样介导盐胁迫诱导的信号传导[24]。另外钙调素还参与许多生物过程，包括酶活性的调节、细胞的分裂和分化、细胞骨架和细胞运动、细胞分泌、渗透调节、光合作用、花粉萌发、激素反应、核内酶系统和基因表达等[25]。钙调素是普遍存在的，在一个特定的植物物种中，不同的 CaM 亚型在表达模式、靶蛋白结合能力以及生理功能上可能是不同的

当蛋白X 与蛋白 Y 间有相互作用时，可以使 BD 和 AD 在空间上接近，进而使下游报告基因表达（图2）。在缺少报告基因表达的氨基酸的培养基上通过观察报告基因是否表达来确定蛋白 X 与蛋白 Y间是否有互作。酵母双杂系统可以用感兴趣的蛋白来筛选互作蛋白，还可以用于检测由 cDNA 文库编码的未知蛋白与目的蛋白间的互作关系。在后一种情况下，酵母双杂交系统成为了研究在特定生物过程中蛋白质之间形成相互作用网络的有力工具。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2;S512.1

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本文编号：2656701