拟南芥子叶白化突变体sca1的筛选及鉴定
发布时间：2020-05-10 22:37
【摘要】：植物从种子萌发到幼苗光形态建成过程,叶绿体发育对于幼苗从异养到光合自养顺利转变至关重要。从初始的原质体到发育有成熟的类囊体结构的叶绿体,其中伴随着光合作用相关基因合成,叶绿素合成,核质信号交流调节叶绿体发育等过程。叶绿体负责植物的CO_2固定、碳骨架制造、脂肪酸、色素和氨基酸合成等。糖在植物的生长发育过程中,不仅是能量来源和结构物质,同时也是植物发育调控的重要信号分子。近年研究证实了糖作为信号分子影响核基因表达,特别是抑制核编码的光合作用基因表达,如叶绿素结合蛋白基因、二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因等。目前,通过多种筛选手段,虽已从植物中分离破坏不同阶段叶绿体发育的多种突变体,并研究相应突变基因在叶绿体发育调节作用,但叶绿体发育的调控机制研究还不完善,需要选择合适角度探究发掘新的突变体。糖作为调节叶绿体发育的关键因素,将糖作为筛选条件,寻找叶绿体发育异常突变体,并研究突变基因在叶绿体发育中的作用,将为深入理解叶绿体发育的机制提供新线索。本研究用缺蔗糖培养基培养EMS(甲基磺酸乙酯)诱变的拟南芥M2突变群体,筛选叶绿体发育异常突变体。获得一株幼苗子叶白化突变体,命名为sca1(seedling cotyledon albino 1)。表型分析发现,突变体sca1幼苗在无糖培养基上子叶呈白化状态,且外源施加各种糖不能恢复其子叶白化表型。与野生型相比,突变体sca1表现叶绿体小且基粒垛叠层少,叶绿素荧光参数F0、Fm和NPQ降低,光合色素含量降低等。随着生长期的延长,突变体sca1的真叶白化有所复绿,但表现生长缓慢,分枝数多,花畸形,结实率低,生长周期长。有文献报道高光下缺乏类胡萝卜素保护的光氧化损伤会导致叶绿素损伤,造成叶片白化。用强弱光处理突变体sca1,发现弱光处理可以使sca1突变体出现子叶复绿,推测sca1子叶白化可能是类胡萝卜素合成缺陷导致叶绿素光氧化损伤。遗传分析显示,突变体sca1表型性状是单基因隐性突变所致。图位克隆显示突变基因定位于二号染色体F14M13和T19L18之间编号为D的BAC上。将该BAC上26个有效基因进行测序分析,发现有三个基因出现有效突变并分别命名为D1、D2和D3。经查阅文献,发现三个基因均为未知基因。为了确定目的基因,特构建了三个基因的35S::GFP载体,并利用基因枪转化和农杆菌侵染转化sca1突变体,发现无论是瞬转材料还是筛选的永久材料,D1基因的转入均能使突变体叶色恢复至绿色,推测D1基因可能是控制突变体子叶白化的基因。亚细胞定位分析,显示D1候选基因编码蛋白定位于细胞核,D2候选基因编码蛋白定位于细胞质,D3候选基因编码蛋白定位于细胞质。综上所述,我们筛选到子叶白化突变体sca1,经过强弱光处理,证明sca1子叶白化可能是类胡萝卜素合成缺陷导致叶绿素光氧化损伤。突变体sca1图位克隆定位到三个候选基因D1、D2和D3。通过瞬时转化和超表达材料的筛选,证明了D1基因控制突变体子叶白化。后续将对已订购的突变体种子进行纯合体鉴定和表型分析,确定突变基因,研究其生物学功能,有望在解释叶绿体发育调控上有所突破。
【图文】：
黄质深度环氧化酶（VDE）形成叶黄素循环，是一种保护植物免受光损伤的机制（Jahnsand Holzwarth, 2012）。图1-2 类胡萝卜素在质体中的代谢途径示意图（Sun et al., 2018）类胡萝卜素合成始于C5 IPP和DMAPP通过MEP途径而形成。其关键步骤酶是GGPS11。而番茄红素环化反应产生了该途径的a和b分支。分别控制类胡萝卜素的转化和类胡萝卜素在质体中的稳定贮藏。Figure 1-2 Schematic representation of the plant carotenoid metabolic pathway in plastids (Sun et al., 2018)Carotenoid biosynthesis begins with the formation of C5 IPP and DMAPP via the MEP pathway. The keyenzyme is GGPS11. Lycopene cyclization yields the a and b branch of the pathway, Control thetransformation of carotenoids and stable storage of carotenoids in plastids.叶绿体是绿色组织中的光合质体。丰富的类胡萝卜素存在于叶绿体类囊体膜中，用于光合作用和光保护作用（Ruban, 2016）。叶绿体中活性类胡萝卜素的生物合成主要发生在包被膜中（Ruiz-Sola and Rodriguez-Concepcion, 2012）。没有类胡萝卜素,叶绿体就不能正常运作，植物也就无法生存。虽然在光合组织中敲除PSY和PDS会导致光合作用的完全废除，但叶黄素生物合成基因的突变并不会导致致死表型，反而会对光保护产生负面影响（KimandDellaPenna, 2006）。光保护是植物在强光胁迫下更好地生存的机制之一。类胡萝卜素通过抑制叶绿素激发态、清除活性氧、将多余能量转化为热能等作用，
拟南芥子叶白化突变体 sca1 的筛选及鉴定14图1-3 图位克隆技术路线示意图（Jander et al., 2002）Figure 1-3 A moderl of gene map-based cloning(Jander et al., 2002)1.7 立题依据根据以上研究背景介绍，我们清楚地了解到植物叶片生长发育、植物叶绿体发育和光合色素合成对光合作用的影响。而叶色突变体的形成又与植物叶片结构、叶绿体代谢、光合色素效率及光合作用有关，目前人们对能直接引起这四个过程变化的研究已经比较透彻，，但还有很多是不直接参与这四个过程也能导致叶绿体发育异常的因素。正如糖不仅作为一种能源物质，在植物中也可以充当信号分子来调节植物的生长发育。而且已经有报导称糖可以抑制光合作用基因表达，也有报道称糖对液体培养的整个幼苗期或莲座叶期拟南芥叶绿体编码基因有显著抑制作用（Gonzaliet al., 2006; Osuna et al., 2007）。寻找新条件探究叶绿体发育异常调控因子意义重大。有研究表明，糖不仅对叶绿体编码转录本和叶绿体形态有作用外，还可以诱导GPT2的表达（Van Dingenen et al., 2016），而缺乏GPT2表达的幼苗子叶的建立和绿化较晚(Dyson et al., 2014)。鉴于叶绿体调节因素的复杂性
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q945
本文编号：2658006
【图文】：
黄质深度环氧化酶（VDE）形成叶黄素循环，是一种保护植物免受光损伤的机制（Jahnsand Holzwarth, 2012）。图1-2 类胡萝卜素在质体中的代谢途径示意图（Sun et al., 2018）类胡萝卜素合成始于C5 IPP和DMAPP通过MEP途径而形成。其关键步骤酶是GGPS11。而番茄红素环化反应产生了该途径的a和b分支。分别控制类胡萝卜素的转化和类胡萝卜素在质体中的稳定贮藏。Figure 1-2 Schematic representation of the plant carotenoid metabolic pathway in plastids (Sun et al., 2018)Carotenoid biosynthesis begins with the formation of C5 IPP and DMAPP via the MEP pathway. The keyenzyme is GGPS11. Lycopene cyclization yields the a and b branch of the pathway, Control thetransformation of carotenoids and stable storage of carotenoids in plastids.叶绿体是绿色组织中的光合质体。丰富的类胡萝卜素存在于叶绿体类囊体膜中，用于光合作用和光保护作用（Ruban, 2016）。叶绿体中活性类胡萝卜素的生物合成主要发生在包被膜中（Ruiz-Sola and Rodriguez-Concepcion, 2012）。没有类胡萝卜素,叶绿体就不能正常运作，植物也就无法生存。虽然在光合组织中敲除PSY和PDS会导致光合作用的完全废除，但叶黄素生物合成基因的突变并不会导致致死表型，反而会对光保护产生负面影响（KimandDellaPenna, 2006）。光保护是植物在强光胁迫下更好地生存的机制之一。类胡萝卜素通过抑制叶绿素激发态、清除活性氧、将多余能量转化为热能等作用，
拟南芥子叶白化突变体 sca1 的筛选及鉴定14图1-3 图位克隆技术路线示意图（Jander et al., 2002）Figure 1-3 A moderl of gene map-based cloning(Jander et al., 2002)1.7 立题依据根据以上研究背景介绍，我们清楚地了解到植物叶片生长发育、植物叶绿体发育和光合色素合成对光合作用的影响。而叶色突变体的形成又与植物叶片结构、叶绿体代谢、光合色素效率及光合作用有关，目前人们对能直接引起这四个过程变化的研究已经比较透彻，，但还有很多是不直接参与这四个过程也能导致叶绿体发育异常的因素。正如糖不仅作为一种能源物质，在植物中也可以充当信号分子来调节植物的生长发育。而且已经有报导称糖可以抑制光合作用基因表达，也有报道称糖对液体培养的整个幼苗期或莲座叶期拟南芥叶绿体编码基因有显著抑制作用（Gonzaliet al., 2006; Osuna et al., 2007）。寻找新条件探究叶绿体发育异常调控因子意义重大。有研究表明，糖不仅对叶绿体编码转录本和叶绿体形态有作用外，还可以诱导GPT2的表达（Van Dingenen et al., 2016），而缺乏GPT2表达的幼苗子叶的建立和绿化较晚(Dyson et al., 2014)。鉴于叶绿体调节因素的复杂性
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q945
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 邓晓娟;张海清;王悦;舒志芬;王国槐;王国梁;;水稻叶色突变基因研究进展[J];杂交水稻;2012年05期
2 何冰;刘玲珑;张文伟;万建民;;植物叶色突变体[J];植物生理学通讯;2006年01期
3 胡希远;王国栋;;脉动磁场对高粱生长发育的影响[J];陕西农业科学;1993年03期
本文编号：2658006
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