IFNγR2的转录调控机制研究

发布时间：2020-05-11 11:23

【摘要】：干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)在先天免疫、炎症反应、适应性免疫、肿瘤免疫等生命过程中发挥至关重要的作用。IFN-γ结合膜表面受体IFN-γR并激活其下游的JAK1、JAK2,进一步磷酸化转录因子STAT1,STAT1进入细胞核内结合靶基因.的特征性GAS(Gamma interferon activation site)元件,启动干扰素刺激基因(interferon stimulated gene,ISG)的表达。ISG中包含有趋化因子、抗原呈递分子、吞噬受体和各种具.有抗.菌抗病毒效应的细胞因子,参与细胞内病原体的防御,炎症与免疫反应调节,肿瘤免疫等免疫过程。IFN-γR由两种亚基组成:IFNγR1和IFNγR2。IFNγR1表达相对过剩,IFN-γ信号通路反应性水平由IFNγR2的表达量决定。因此阐明IFNγR2的调控机制有助于深入理解与IFN-γ信号通路有关的免疫反应和疾病发生过程,具有潜在的临床意义。目前关于IFNγR2的研究主要涉及其定位及功能,其转录调控机制研究少见报道。本研究拟通过构建IFNγR2荧光报告系统,为发现可调控IFNγR2转录水平的基因、小分子药物,进一步探索其调控方式和及其分子机制等提供有力工具。我们将小鼠Ifngr2基因的启动子序列放置于绿色荧光蛋白开放阅读框架上游,并将其共同插入慢病毒载体中,进一步通过慢病毒感染系统构建稳定表达Ifngr2启动子调控EGFP表达的Myc-Cap细胞系,以此细胞系用作研究IFNγR2调控的荧光报告体系。我们发现肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和奥沙利铂:(oxaliplatin):可以明显:上调Ifngr2基因的转录水平。TNF-α是机体系统性炎症急性期的重要细胞因子,主要由激活的巨噬细胞分泌,调控各种免疫过程并可诱导肿瘤细胞凋亡。TNF-α结合细胞表面的TNFR,激活下游NF-κB信号通路和MAPK信号通路。我们发现过表达NF-κB的亚基p65可上调Ifngr2。分别用IKK-β抑制剂IKK2 inhibitor IV、ML120B和蛋白酶体抑制剂MG132抑制NF-κB信号通路时候的激活,TNF-α均不能上调Ifngr2。这表明TNF-α通过NF-κB信号通路调控Ifngr2,这种调控发生在转录水平。MAPK信号通路抑制剂U1026、SP100625不能阻断TNF-α促进Ifngr2上调,提示MAPK信号通路可能不参与TNF-α上调Ifngr2的过程。为进一步明确Ifngr2启动子中关键的转录元件,我们构建小鼠Ifngr2基因启动子荧光素酶报告系统,通过系列截短分析探索Ifngr2基因启动子中转录调控的关键区域。生物信息学工具分析发现Ifngr2基因启动子-111--102片段GGGAAAGTCC为NF-κB结合位点,并通过突变分析对其进行了确认。Oxaliplatin作为一种抗肿瘤药物,广泛应用于多种肿瘤的化疗方案中。在细胞水平我们发现oxaliplatin.上调IFNγR2。我们建立了Myc-Cap皮下移植瘤动物模型型在动物水平初步探索了oxaliplatin对IFNγR2的调控作用和抗肿瘤免疫效应。本研究中我们构建了IFNγR2荧光报告体系,发现了TNF-α和oxaliplatin明显上调IFNGR2转录水平,并明确了TNF-α通过NF-κB信号通路调控IFNγR2。通过构建荧光素酶报告系统,发现并验证了Ifngr2启动子中NF-κB结合位点。我们还对oxaliplatin对IFNγR2和抗肿瘤免疫的调控作用进行了初步探索。以上研究共同为阐明Ifngr2的转录调控机制打下坚实的基础。
【图文】：

示意图,报告体系,荧光,基因启动子

第 38 页图 1 IFN R2 荧光报告体系的构建A. IFN R2 荧光报告体系的示意图 B. 从 MEF 基因组扩增 Ifngr2 基因启动子-1344~+48 区域，泳道 1 为 PCR 产物，M 为 DNA marker C. 稳定表达Ifngr2-promoter-EGFP 细胞系 Myc-Ifngr2 基因组 EGFP 特异性引物 PCR 结果，空细胞为阴性对照 D.流式分析 Myc-Ifngr2 的平均荧光值2 TNF- 和 Oxaliplatin 上调 IFN R2应用 IFN R2 荧光报告体系，我们发现肿瘤坏死因子（tumor necrosis factoralpha，，TNF- ）和化疗药物奥沙利铂（oxaliplatin）均能提高报告体系平均荧光值（mean fluorescent intensity，MFI）。如图 2A、2B 所示 20 ng/mL TNF- 处理细胞48h，2 nM oxaliplatin 处理细胞 48h，报告系统 MFI 均显著提高。这提示 TNF- 和

报告体系,信号通路

图 2 TNF- 和 oxaliplatin 上调 IFN R2 的表达A. TNF- 上调 Myc-Ifngr2 报告体系 MFI B. Oxaliplatin 上调 Myc-Ifngr2 报告体系 MFI第二部分 TNF-α 通过激活 NF- B 通路上调 Ifngr21 TNF- 上调 Ifngr2TNF- 是一类细胞因子，在免疫和炎症等生命活动中发挥关键作用。TNF-可以通过细胞膜表面的 TNF 受体激活三条信号通路，分别是 NF-κB 信号通路、MAPK 信号通路和 caspase8 依赖的凋亡信号通路。TNF- 可以刺激细胞产生多种细胞因子，如 IL-6、IFN- 、IFN-β 等，但其对 IFN- 信号通路影响的并不明确。为了验证 TNF- 对于 IFNGR2 的调控作用，我们通过 qPCR 技术检测了 TNF- 对Ifngr2 的表达水平的影响。20ng/mL TNF- 刺激 Myc-Cap 细胞系 1h、3h，Ifngr2
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q75

【相似文献】