嗜热菌丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的原核表达、纯化及活性分析

发布时间：2020-05-11 16:19

【摘要】：嗜热菌,是一类能适应高温的微生物。其生长速度较快,代谢较强,在高温下有着显著的生存优势,在环境保护、能源利用等方面具有广泛的应用。嗜热酶,是从嗜热菌中分离得到,能够适应高温反应条件的酶。酶偶联法是体外测定酶活性的常用方法之一。如:丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)是测定核苷二磷酸(nucleoside diphosphate,NDP)生成反应的常用偶联酶。嗜热菌苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus pallidus JH-7)的最适生长温度为50℃。为了分析其PK和LDH是否可以作为50℃反应条件的偶联酶,本研究从A.pallidus JH-7基因组中克隆其pk和ldh,分别构建入表达载体pET24a,经蛋白质的诱导表达、纯化得纯度达95%以上的apPK和apLDH。利用分光光度法,分别对apLDH和apPK的催化效率和动力学常数及进行了探讨,我们发现apPK的最适底物为ADP,其催化效率是5×10~4M~(-1.)s~(-1),最适pH为8.0,最适温度为45℃;NADH为apLDH的最适底物,催化效率为3.7×10~5 M~(-1·)s~(-1),最适pH为5.8,最适温度为35℃。虽然50℃不是apLDH和apPK的最适温度,但它们在此温度下k_(cat)分别为16.4 s~(-1)和64.5 s~(-1),暗示它们可以作为此温度下的偶联酶。TFSAC(Thermobifida fusca,嗜热放线菌;硫酸盐复合体)是嗜热放线菌的硫酸盐活化酶复合体,其缺失了ATP硫酸化酶的活性,但是具有腺苷磷酰硫酸激酶(adenosine 5'-phosposulfate kinase,APSK)的活性。APSK在硫的同化代谢中具有不可替代的功能。利用apLDH和apPK作为偶联酶,分析了其在50℃的反应条件下,其底物ATP和APS的动力学常数。结果我们发现K_(mAPS)为0.65μM,k_(cat)值为4.6 s~(-1)。而在25℃的反应条件下,其K_(mAPS)为0.56μM、k_(cat)为2.45s~(-1)。所以在50℃的反应条件下,TFSAC酶APSK的k_(cat)值是25℃反应条件下的1.9倍,K_(mAPS)值是25℃反应条件下的1.1倍,其APSK活性在50℃和25℃的活性相差不大,也说明apLDH和apPK可以作为偶联酶应用于NDP的测定。
【图文】：

appk的扩增图

apldh的扩增图
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936

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本文编号：2658735