棉花细胞质雄性不育相关基因orf160的原核表达与抗体制备

发布时间：2020-05-12 17:14

【摘要】：棉花细胞质雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility,CMS)系已应用于棉花杂交育种的生产实践,但棉花CMS机理尚不清楚。之前研究发现,哈克尼西棉CMS系线粒体基因组中存在一个特有的开放阅读框(ORF):orf160,该ORF在棉花CMS系中是转录的,但在棉花正常可育系中未检测到该ORF的表达,推测orf160可能与棉花CMS相关。但该ORF在蛋白水平表达情况如何尚不清楚,且缺乏相应的研究用抗体,所以有必要制备出ORF160蛋白的抗体,为后续进一步探究orf160在蛋白表达水平的差异、明确orf160与棉花CMS的相关性奠定基础。本文对orf160基因进行原核表达密码子优化,合成并分析,PCR扩增并引入Rsr II和Not I限制性酶切位点,双酶切法构建重组表达载体;利用E.Coli BL21(DE3)原核表达目的蛋白ORF160,确定表达形式,优化表达条件,Ni~(2+)柱纯化,抗His-tag抗体的Western Blot检测;以ORF160为抗原腹腔免疫Balb/C鼠制备鼠单抗,测定效价,鉴定抗体特异性,初步建立检测ORF160的双抗体夹心法。结果表明目的基因orf160共480 bp,编码159个氨基酸,将orf160双酶切后连接表达载体pET-B2M,经鉴定成功构建重组表达载体orf160-pET-B2M。目的蛋白ORF160在E.Coli BL21(DE3)中表达为包涵体蛋白,符合预期蛋白分子量;0.1 mM的IPTG,30℃诱导表达4 h为目的蛋白最佳表达条件,经Ni~(2+)柱纯化的蛋白浓度为1.1 mg/mL;Western Blot结果显示ORF160与抗His-tag抗体特异性结合,说明成功表达目的蛋白;以纯化ORF160制备鼠单抗,共筛选出三株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株:2B9(6 400×)、2G10(6 400×)和3E9(3 200×);特异性实验表明,三种抗体对目的蛋白具有特异性,初步建立检测ORF160的免疫学方法,检测限不高于1.25μg/mL。本实验成功构建原核表达载体orf160-pET-B2M,表达纯化ORF160蛋白;成功制备出抗ORF160鼠单抗,初步建立能够用于检测ORF160的免疫学检测方法。本研究为探究orf160与棉花CMS的相关性奠定基础。
【图文】：

芸薹属CMS-pol orf224/atp6CMS-ogrua orf138/atp8CMS-juncea orf108/atpA小 麦 CMS-T orf256/cox1向日葵 CMS-pet1 orf522/atpA水 稻CMS-BT orf79/atp6CMS-HL orfH79/atp6萝 卜 CMS-kos orf125/atp8矮牵牛 CMS-S Pcf/nad3/rps12这些不育基因起初被认为是未知功能的 ORF，它们来源于线粒体编码 RNA[21]，，以嵌合序列的形式存在，这些不育基因与功能基因子水平影响线粒体的正常代谢途径[23]，或者产生毒性蛋白[21]。植是庞大而复杂的，基因组时有突变、重排、核-质互作的发生，都的功能，进而影响细胞的正常代谢和生命活动，包括和育性相关终导致植物育性丧失。

形的不良发育现象，这些研究足以证明该基因与棉花 CMS 具有相关性，将0 确定为棉花 CMS 相关基因。随后，李杨等[41]也证实了这一点。外源基因的原核表达原核表达外源基因的常用系统是大肠杆菌表达体系，因其在原核表达方面最研究和应用，是原核表达外源蛋白的成熟菌种，优点是菌种廉价易得，技术成熟，繁殖速度快，同时对多数外源蛋白具有耐受能力，蛋白表达效率高，大规模培养，实验周期短。近年来，已经建立了多种用于高效表达外源蛋白统，主要在载体和宿主的选择、目的基因的优化上加以改进。1 载体和宿主的选择（1）表达载体的选择：载体应该包含用于克隆和表达外源基因的所有特定的元件，如图 1.2。包括强子、终止子、核糖体结合位点、筛选标记、纯化标签等。
【学位授予单位】：长春理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2

【参考文献】

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1 王继s

本文编号：2660567