转录因子SP1调控小鼠原始卵泡形成的机制研究

发布时间：2020-05-12 18:04

【摘要】：原始卵泡作为雌性生殖的基本功能单位,其储备库的建立具有两个特点:一是几乎所有哺乳动物原始卵泡的形成都是在妊娠中后期(如人)或出生前后(如小鼠)完成;二是大量的卵母细胞最终只能形成一定数量的原始卵泡。因此,原始卵泡库是雌性哺乳动物不可再生的生殖资源,原始卵泡形成失败或提早衰竭会引起卵巢早衰(Premature ovarian insufficiency,POI)。原始卵泡的形成是一个卵母细胞与体细胞互作的复杂生理过程,需要多种基因的时空性差异表达。其中,转录因子作为一类调控基因表达和决定细胞命运的关键分子,其在原始卵泡形成中的功能却鲜有报道。本文我们研究了转录因子SP1在小鼠原始卵泡形成中的主要功能及作用机制。研究发现,SP1在小鼠卵巢的卵母细胞及体细胞中均有表达,且表达水平伴随原始卵泡的形成逐渐升高,并在原始卵泡形成完成后表达回落。为了明确SP1在原始卵泡形成中的作用,我们利用慢病毒敲降结合胚胎卵巢体外培养模型发现,敲降Spl显著抑制了小鼠原始卵泡的形成,同时卵母细胞的数量显著增多。进一步利用胚胎卵巢体外重构实验表明,SP1主要在体细胞中发挥功能。为了探究SP1在体细胞中的作用,一方面我们利用Lgr5-EGFP-ires-CreERT2(LGR5-KI)转基因小鼠结合全卵巢敲降模型发现,SP1缺失显著抑制了前颗粒细胞从卵巢表面上皮LGR5阳性细胞的募集;另一方面利用FOXL2阳性细胞特异性敲降模型证明,SP1还调控了前颗粒细胞的维持。进一步的研究发现,与全卵巢敲降Sp1的表型相一致,在前颗粒细胞中特异性敲降SS1显著抑制了原始卵泡形成和卵母细胞凋亡,导致大量卵母细胞以合胞体的形式存在于卵巢中。通过对SP1发挥功能的机制进一步研究证明,体细胞表达的Notch2介导了 SP1对前颗粒细胞发育及原始卵泡形成的调控。体内染色质免疫共沉淀及体外双荧光素酶实验结果表明,SP1可以直接与Notch2启动子区结合进而调控其转录。为了探究由于SP1缺失导致的前颗粒细胞发育受阻是否会影响合胞体中卵母细胞的进一步发育,我们通过体外延长培养时间以及体内肾被膜移植实验发现,在SP1缺失的卵巢中,卵泡和卵母细胞在青春期前发生了大规模丢失,导致POI的发生。同时,在Sp1被沉默的区域,Notch2和FOXL2的表达也出现同步化下调,证明SP1调控的前颗粒细胞发育对于青春期前卵泡的存活也是至关重要的。综上所述,我们的研究证明了 SP1作为一个控制颗粒细胞发育的关键转录因子,通过Notch2介导的信号通路调控了原始卵泡库的建立与维持。这项研究为揭示体内卵泡发育的机理奠定了理论基础;同时,对于促进辅助生殖医学的进步,以及对于因卵泡发育问题而导致的POI等生殖疾病的预防和治疗具有重要的理论指导意义。
【图文】：

第一■章文献综述逡逑２００６）。研究表明原始卵泡的形成需要卵母细胞与体细胞在分裂和分化进程上保持高逡逑度一致，二者才能彼此互作形成原始卵泡（Ｌｅｉ邋ｅｔａｌ．，邋２００６）。图１－１总结了小鼠原始卵逡逑泡形成过程中主要发育事件的时空分布情况。接下来，我们将对原始卵泡形成这一生逡逑理过程进行详细介绍。逡逑Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ逡逑Ｇｅｒｍ邋Ｃｅｌｌｓ逦Ｇｅｒｍｌｉｎｅ逦Ｃｙｓｔ逦Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ逦Ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ逡逑ＡＲＭＩＮＧ逦ｃｙｓｔｂｒｅａｋｄｏｗｎ邋ｐＲ｜Ｍ0Ｒ0｜ＡＬ逡逑ＣＹＳＴＳ逦ＦＯＬＬＩＣＬＥＳ逡逑ＣＹＳＴＳ逦逦逦逡逑１１逦Ｉ：逦ｎ逦１４逦ＩＳ逦ｌｆｔ邋ｒ逦ＩＫ邋１９逦２０逦：ｌ逦：：逦２３逦：４逦：５逦ｄＰ°逡逑１逦Ｉ逦１逦Ｉ逦１逦ＩＩ逦ＩＩ逦Ｉ逦１邋Ｉ逦Ｉ逦１１逡逑＿逦７＂＾逦ｌ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑ｍｉｔｏｓｉｓ逦Ｉ逦：逦２逦３逦４逦ｓ逦６逦ＰＮＤ逡逑ａｒｒｉｖａｌ逦Ｏｏｃｙｔｅｓ邋Ｌ邋匕邋ｍｍ邋ｍｍ邋ｍ逡逑ａ，邋ｇｏｎａｄ邋Ｇｅｒｍ邋ｃｅｌｌｓ逦ｂｅｇｉｎ逦ｂｉｒｔｈ邋ｇｅｒｍ邋ｃｅｌｌ邋ｄｅａｔｈ逡逑ｂｅｇｉｎ邋ｔｏ逦ｔｏ逦ａｒｒｅｓｔ逡逑ｅｎｔｅｒ邋ｍｅｉｏｓｉｓ邋ａｔ邋ｄ丨ｐ丨ｏｔｅｎｅ逡逑图１－１原始卵泡形成中不同发育事件的时空分布图（Ｐｅｐｌｉｎｇ，邋２００６）逡逑ＰＧＣｓ在１０．５邋ｄｐｃ左右到达生殖嵴，生殖细胞合胞体形成；１３．５邋ｄｐｃ时生殖细胞开始进入第一次减逡逑数分裂

分裂（Ｂｏｒｕｍ，邋１９６１；邋Ｃｏｎｔｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１２；邋Ｓｌｉｚｙｎｓｋｉ，邋１９５７）。在此期间，卵母细胞会发生一逡逑系列如同源染色体联会、ＤＮＡ重组、同源染色体分离而姐妹染色单体不分离等区别逡逑于有丝分裂的独特事件。图１－３即为各时期染色体的典型形态。逡逑Ａ．Ｌｅｐｔｏｔｅｎｅ邋Ｂ．Ｚｙｇｏｔｅｎｅ邋Ｃ．Ｐａｃｈｙｔｅｎｅ邋Ｄ．Ｄｉｐｌｏｔｅｎｅ邋Ｅ．邋Ｄｉｃｔｙａｔｅ逡逑ｉＨＱＨＳＤ逡逑图１－３卵母细胞第一次减数分裂前期各时期的染色体形态图（Ｗａｎｇ邋ｅｔａｌ．，２０１５ａ）逡逑利用染色体铺展与核型分析的方法展示卵母细胞第一次减数分裂前期各时期的染色体形态，其中逡逑绿色为联会复合体蛋白（Ｓｙｎａｐｔｏｎｅｍａｌ邋ｃｏｍｐｌｅｘ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋３，ＳＹＣＰ３）标记染色体，蓝色为Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑标记细胞核。各个时期的定义如下：（Ａ）细线期（ｌｅｐｔｏｔｅｎｅ）－染色体表现为乱麻的线状聚集；（Ｂ）偶逡逑线期（ｚｙｇｏｔｅｎｅ）－染色体变粗变短，出现联会复合体结构（Ｓｙｎａｐｔｏｎｅｍａｌ邋ｃｏｍｐｌｅｘ，邋ＳＣ）；邋（Ｃ）粗线期逡逑（ｐａｃｈｙｔｅｎｅ）－完成染色体配对，染色体变得更粗更短；（Ｄ）双线期（ｄｉｐｌｏｔｅｎｅ）－同源染色体分离；（Ｅ）逡逑核网期（ｄｉｃｔｙａｔｅ）－ＳＹＣＰ３从染色体上解离下来，染色体不再清晰可见，细胞核中能观察到２－４个逡逑核小体。标尺：ｌＯｐｉｕ逡逑研究表明，来源于中肾的视黄酸（Ｒｅｔｉｎｏｉｄ邋ａｃｉｄ，ＲＡ）是生殖细胞启动减数分裂的逡逑关键信号（Ｂｏｗｌｅｓ邋ｅｔ邋ａｌ．
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q492
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本文编号：2660622