Athrobacter ramosus的MTSase和MTHase的重组表达及应用

发布时间：2020-05-13 02:11

【摘要】：海藻糖是一种天然低聚二糖,是许多植物、昆虫和微生物在逆性环境下的应激代谢物,具有低卡、稳定、保湿和防晒等优点,广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。海藻糖主要是以淀粉为底物经麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase,EC3.2.1.141)连续作用获得,但是目前报道的这两种酶的表达宿主大多为大肠杆菌,其含有的内毒素不利于食品酶的制备,而枯草芽孢杆菌不分泌内毒素,且发酵周期适中、培养方便,是食品级酶制剂表达宿主的最佳选择之一。本实验室前期构建了重组表达Athrobacter ramosus S34来源的MTSase和MTHase的B.subtilis WS11/pHY300PLK-Y和B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z,本研究对其进行摇瓶及3-L罐水平的发酵优化,同时分别研究了两种重组酶的酶学性质。构建了重组菌B.subtilis WB600/pHY300PLK-Z和B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z,并对后者进行摇瓶及3-L罐发酵优化。最后优化了海藻糖的制备工艺,并将此工艺进行中试试验,随后对海藻糖的分离提取条件做初步探索。主要研究结果如下:(1)将重组菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Y进行摇瓶发酵,考察了重组MTSase的pH温度性质。结果表明:该酶的最适温度为45℃、pH 6.0,45℃的半衰期为76 h,与大肠杆菌表达获得的酶相似。进一步优化重组菌的培养基组分,结果表明:其最适碳源和氮源为葡萄糖5 g·L~(-1)、工业蛋白胨10 g·L~(-1)和玉米浆25 g·L~(-1),此时重组MTSase的酶活为63.2 U·mL~(-1);在此基础上,探究重组菌在3-L发酵罐中的发酵pH及补料碳氮比。结果表明:在pH 7.0,葡萄糖为补料碳源,工业蛋白胨和玉米浆为补料氮源,C/N为1:1条件下酶活最高为1139.2 U·mL~(-1),比摇瓶发酵优化前提高了18倍。(2)将重组菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z进行摇瓶发酵,考察了重组MTHase的pH温度性质。结果表明:该酶的最适温度为55℃、pH 5.5,45℃的半衰期为4 h,与大肠杆菌表达获得的酶相似。进一步优化重组菌的培养基组分及木糖诱导浓度,结果表明:最适碳源和氮源为甘油5 g·L~(-1)、工业蛋白胨25 g·L~(-1)和大豆蛋白胨10 g·L~(-1),最适诱导浓度为5 g·L~(-1)木糖,此时重组MTHase的酶活为74.7 U·mL~(-1)。在此基础上,探究重组菌3-L发酵罐中的木糖诱导流速及补料碳氮比。结果表明:以甘油为补料碳源、工业蛋白胨和大豆蛋白胨为补料氮源,C/N为2:1,木糖诱导速率为0.5 g·L~(-1)·h~(-1)的条件下发酵,酶活最高为294.2 U·mL~(-1),仅为摇瓶发酵优化前的3.9倍。该重组菌在3-L罐发酵40 h后酶活迅速降低,存在发酵放大不稳定的问题。(3)为了考察不同B.subtilis宿主菌对MTHase产量的影响,构建重组菌B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z和B.subtilis WB600/pHY300PLK-Z,其中重组菌B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z酶活更高为54.7 U·mL~(-1)。接着对该重组菌的培养基组分进行优化,结果表明:最适碳源和氮源为甘油5 g·L~(-1)、大豆蛋白胨25 g·L~(-1)和玉米浆5 g·L~(-1),此时重组MTHase的酶活为71.3 U·mL~(-1)。并在3-L罐水平上优化该重组菌的补料碳氮比。结果表明:以甘油为补料碳源,大豆蛋白胨和玉米浆为补料氮源,补料C/N为1:1时,酶活最高为816.2 U·mL~(-1),是重组菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z最高酶活的2.8倍。(4)在pH 6.0、45℃的条件下,以DE值17-20、浓度为200 g·L~(-1)的大米淀粉为底物,经上述重组酶催化40 h海藻糖转化率为52.6%。由于体系中含有较多的麦芽三糖和麦芽糖等副产物,利用环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的歧化活性将其聚合度延长,提高底物利用率。与Bacillus stearothermophilus来源的α/β-CGTase复配作用后,催化周期缩短至30 h,转化率提高至68.6%。在此优化基础上进行10吨罐中试试验,转化率为65.4%。随后对海藻糖进行分离提取,分别考察确定了活性炭脱色、离交分离及浓缩结晶的最适条件,海藻糖最终收率为80.1%。
【图文】：

α,α-海藻糖结构式Fig.1-1Thestructureoftrehalose

[29]。随后，日本林原研究所从节杆菌(Arthrabaccter sp. Q36)中分离出MTSase和MTHase，二者能联合先后作用于麦芽寡糖生成海藻糖。其作用机理如图1-2所示，MTSase将麦芽寡糖或直链淀粉转化为麦芽寡糖基海藻糖，接着在MTHase水解的作用下，得到一分子海藻糖和减少两个葡萄糖的麦芽寡糖，如此循环作用至麦芽寡糖的DP≤2[30]，对海藻糖的转化率在80%以上。双酶法反应的条件温和，操作简便且生产成本较低，是目前海藻糖制备的最佳选择，国内外多家企业已经用于工业化海藻糖制备生产[10]的。图 1-2 双酶法制备海藻糖的?
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 孟建华;;日两家公司计划用基因重组菌工业生产酶[J];生物工程进展;1988年01期

2 金梅林;;预防新生仔猪肠毒性大肠杆菌病的DNA重组菌毛菌苗的研制及保护效果[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;1989年04期

3 和晓贤;李青云;唐爱星;刘幽燕;;源自重组菌BL21-pET28a-cdE降氰酶的基本性质研究[J];广西大学学报(自然科学版);2018年03期

4 陈璇;刘松;冯岳;堵国成;陈坚;;常压室温等离子诱变选育L-天冬酰胺酶高产重组菌[J];食品与生物技术学报;2016年05期

5 叶勤;基因重组菌高密度培养研究[J];国外医药(抗生素分册);2003年05期

6 诸葛斌;堵国成;诸葛健;陈坚;;重组菌产碱性果胶酯裂解酶酶学性质研究[J];微生物学报;2008年01期

7 吴晓燕;郭妍;惠长野;陈剑辉;高朝贤;曾新军;;PbrR大肠埃希菌外膜展示株体内外生长特性[J];中国热带医学;2017年07期

8 张晓梅;诸葛斌;许正宏;窦文芳;黄瑞;许赣荣;;产3-羟基丙酸重组菌的构建及其转化甘油的研究[J];生物技术通报;2009年08期

9 孙金凤;王正祥;;新型产乙醇重组菌利用葡萄糖和木糖的乙醇发酵[J];食品与发酵工业;2008年05期

10 赵建芬;韦寿莲;张广;;重组菌转化香兰素生产香兰素酸的研究[J];食品科学;2009年23期

相关会议论文 前6条

1 黄江;张明明;伦镜盛;黄通旺;胡忠;;Enterobacter sp.CN1产氢代谢调控的初步研究[A];广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会论文及摘要汇编[C];2014年

2 王玉梅;刘畅;蒙冲;郭风云;;HEV ORF_2重组菌菌种的稳定性及融合蛋白的应用[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展（上册）[C];2001年

3 沙冲;喻晓蔚;徐岩;郅岩;孔宇;;通过基因拷贝数优化及重组菌表型优化提高华根霉CCTCC M201021脂肪酶proRCL在毕赤酵母中的表达水平[A];第八届中国酶工程学术研讨会论文集[C];2011年

4 孟庆玲;才学鹏;乔军;景志忠;张艳;田广孚;郭爱疆;;中国白兔白介素-10基因的克隆、表达及其多克隆抗体的制备[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年

5 王贤波;王丽鸳;成浩;周健;;茶氨酸生物合成工程菌的构建[A];第四届海峡两岸茶业学术研讨会论文集[C];2006年

6 丁轲;余祖华;程相朝;张春杰;王天奇;;绿色荧光蛋白基因作为示踪基因标记乳酸杆菌[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集（上册）[C];2008年

相关博士学位论文 前10条

1 陈新爱;基因工程菌培养若干重要问题的研究[D];浙江大学;2002年

2 张大伟;微生物中生产辅酶Q_(10)的研究[D];北京化工大学;2007年

3 丁庆豹;核苷磷酸化酶的克隆、表达与应用[D];华东理工大学;2010年

4 张晓梅;遗传改造Zymomonas mobilis代谢木糖及其木糖醇产生机制的研究[D];山东大学;2009年

5 罗紫臣;纤维素酶的分泌表达及其在生物炼制中的应用[D];华东理工大学;2015年

6 吕桂善;乳源抗高血压生物活性肽在大肠杆菌中表达的研究[D];东北农业大学;2003年

7 王振华;猪繁殖与呼吸综合征病毒重组乳酸乳球菌粘膜免疫疫苗的构建及免疫原性评价[D];四川农业大学;2012年

8 胡静涛;新城疫病毒HN基因重组乳酸菌抗小鼠结肠癌及免疫机制的初步研究[D];吉林大学;2015年

9 沙冲;华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶在异源宿主中的高效分泌表达[D];江南大学;2015年

10 秦秀林;构建 GAP启动子文库提高重组毕赤酵母S-腺苷甲硫氨酸合成[D];华东理工大学;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 邹亮;Pantoea dispersa蔗糖异构酶在芽孢杆菌中的表达及发酵优化[D];江南大学;2019年

2 封金云;Athrobacter ramosus的MTSase和MTHase的重组表达及应用[D];江南大学;2019年

3 张小可;双基因共表达策略对高山被孢霉重组菌合成EPA的作用研究[D];江南大学;2018年

4 和晓贤;产降氰酶重组菌BL21-pET28a-cdE的氰代谢及特性研究[D];广西大学;2017年

5 范如婷;聚3-羟基丙酸重组菌构建及代谢调控[D];北京化工大学;2015年

6 黄文晶;高产碱性蛋白酶重组菌及其发酵性能[D];江南大学;2012年

7 周小艳;甲酸脱氢酶基因的克隆表达及重组菌的高密度培养[D];浙江大学;2008年

8 吴小芳;双重组菌偶联不对称还原制备（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[D];江西师范大学;2013年

9 董坤;产谷胱甘肽酿酒酵母重组菌的构建及发酵研究[D];山东大学;2012年

10 邵坤彦;重组菌中谷氨酰胺转胺酶表达及纯化的研究[D];中南民族大学;2012年

，

本文编号：2661202