日本七鳃鳗BCAP基因克

发布时间：2020-05-13 14:28

【摘要】：BCAP又名PI3KAP1(phosphoinositide-3-kinase adaptor protein 1),BCAP含有四个YxxM基序。当B细胞受体(BCR)信号启动后,YxxM基序上的Tyr磷酸化可以募集到磷酸肌醇3-激酶(PI3K)的P85α亚基并激活PI3K,活化的PI3K可以介导其下游激酶Akt磷酸化,进而入核调控基因的转录和表达,并最终参与调节B淋巴细胞的增殖,存活,代谢,细胞骨架重组与膜运输。七鳃鳗是具有很高研究价值的模式生物,因为它是在进化上联系脊椎动物和无脊椎动物的最原始的无颌类脊椎动物代表。在无颌类脊椎动物中是否存在BCAP以及功能如何尚无人报道。本研究在日本七鳃鳗(Lampetra japonica)中首次发现了BCAP基因,并采用嵌套PCR扩增技术用高保真酶对BCAP基因的cDNA进行了分子克隆。日本七鳃鳗BCAP分子(Lja-BCAP)开放阅读框的长度为2181bp,编码含有726个氨基酸残基的蛋白质。通过对不同脊椎动物BCAP的蛋白质序列进行比对分析发现,无颌类脊椎动物日本七鳃鳗原始类型的适应性免疫系统中也存在BCAP。为了更深入明确其进化关系,通过构建进化树发现,虽然与高等脊椎动物遗传距离较远,但BCAP在无颌类脊椎动物中已经进化出现。为了进一步了解Lja-BCAP在免疫调节中的作用,我们制备了Lja-BCAP兔源多克隆抗体。首先构建了pET-32a(+)-Lja-BCAP重组质粒,将重组质粒导入E.coli Rosetta表达菌诱导蛋白表达并进行了纯化,以纯化后的重组蛋白作为抗原免疫刺激新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备兔源多克隆抗体,采用耳动脉取血的方式抽取血液制备抗血清,并将抗血清分离并纯化,得到了特异性较好的Lja-BCAP兔源多克隆抗体。利用siRNA干扰技术对Lja-BCAP分子的mRNA进行了体内干扰敲低实验。在核酸和蛋白水平上检测的结果表明:在注射了所设计的3组siRNA混合库以后又免疫刺激日本七鳃鳗单个核白细胞和髓样小体,Lja-BCAP分子的mRNA转录和蛋白翻译水平均能在随后的12-36h内被有效敲低。此结果为后续深入探索Lja-BCAP分子的功能奠定基础。通过反转录PCR和Western blot实验检测经PHA免疫处理后Lja-BCAP在mRNA转录水平和蛋白水平上的相对表达量,结果表明,在免疫处理前Lja-BCAP的mRNA在单个核白细胞、鳃组织和髓样小体中均有表达,并且在单个核白细胞中的表达量明显高于其它两个组织。Lja-BCAP在单个核白细胞中其mRNA水平和蛋白水平在PHA免疫处理后36h表达量呈现出显著的上调。这些数据表明,Lja-BCAP可能参与了日本七鳃鳗VLRB~+淋巴细胞(类B细胞)的免疫应答过程,我们的研究结果为进一步研究BCAP分子在日本七鳃鳗淋巴细胞免疫应答过程中的作用奠定了基础。
【图文】：

图 2.4 髓样小体总 RNA 的提取结果及反转录后的模板检验：DL2000 Marker；1、2 泳道均为髓样小体总 RNA（B）M：DL2000 Marker；1：gapdh.4 Total RNA electrophoretogram of supraneural myeloid body and template test after transcription(A)M:DL2000 Marker;1,2: Supraneural myeloid body total RNA(B)M:DL2000 MarkeHousekeeping gene gapdh

图 2.5 Lja-BCAP 基因的 ORF 区克隆；（A）M：DL5000 Marker；1：BCAP 基因的 PCR 产物；（B）M：DL5000 Marker；1：BCAP 基因的嵌套 PCR 产物；（C）M：DL5000 Marker；1：目的基因的胶回收；（D）M：DL5000 Marker；1:连接转化后菌液 PCR 产物；（E）M：DL5000 Marker；1：连接目的基因的质粒；Fig. 2.5 Lja-BCAP ORF gene clone(A)M:DL5000 Marker;1: BCAP PCR products; (B)M:DL5000 Marker;1: BCAP Nested PCR products;(C)M:DL5000 Marker;1: BCAP gel recycling products;(D)M:DL5000 Marker;1: colony PCRproducts;(E)M:DL5000 Marker;1: BCAP plamid
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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本文编号：2662099