细菌耐丁醇元件的挖掘及大肠杆菌的溶剂耐受性研究

发布时间：2020-05-13 13:47

【摘要】：微生物对有机溶剂的耐受能力在许多生物燃料有效生产中是至关重要的,并且在非水相催化工业生物技术中也占据关键地位,因此,获得一株溶剂耐受能力较好的宿主菌具有很大的研究价值和工业应用潜力。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是常被用于环境生物修复、生物活性物质合成等领域的重要工业微生物。大肠杆菌(Escherichia coli)是一类遗传背景清晰的平台微生物,其较差的有机溶剂耐受性成为工业化应用的瓶颈。本文基于sRNA调节基因及其分子伴侣工程、ARTP随机诱变技术两个研究方向来获得高正丁醇耐受性的大肠杆菌。一方面,通过在E.coli JM109中过表达sRNA调节基因(hfq,fur,sgrs和rpoS)或RNA伴侣基因(hfq,fur,rpoH,stpA,nusB,cspC,cspD,proQ和ffh)来改善对正丁醇的耐受性。在添加8 g·L~(-1)正丁醇的条件下,JM109/pQE80L-rpoS过表达菌株的耐受性相比于对照菌株提高了41%。然后,将rpoS基因与两个分子伴侣基因(secB和groS)共表达。在9.6 g·L~(-1)正丁醇浓度下,菌株JM109/pQE80L-groS-secB-rpoS的正丁醇耐受性是对照菌株的近3倍,并且通过实验发现基因的表达顺序差异会影响菌株的正丁醇耐受性。此外,通过构建rpoS基因随机突变文库,筛选了10000个左右的突变体,最终获得正丁醇耐受性提高1.5倍的突变体C11和1.8倍的突变体D5。另一方面,基于ARTP随机诱变技术对P.putida 901进行诱变,再经过一系列正丁醇浓度下的传代驯化,获得在8 g·L~(-1)的正丁醇添加下耐受性提高了约2倍的突变体,并且其对正丁醇的最大耐受浓度进一步提高到12 g·L~(-1)。通过Illumina HiSeq平台对突变株与对照菌株进行全基因组重测序,结果显示共获得大约1900万对reads,平均读长为150nt,与参考基因组的片段配对率为92.03%,覆盖率为90.34%。共检测到40704个单核苷酸位点变异(Single Nucleotide Variation,SNV),其中纯合的为39319个,杂合的为1385个;存在2153个基因小片段插入/缺失序列(InsertDeletions,InDels),其中纯合的突变位点数量为1871个,杂合的突变位点数量为282个。最后,将所有突变进行GO/KEGG数据库功能注释,发现突变数目最多的是涉及到代谢相关基因,其中以氨基酸代谢和糖代谢路径相关基因为主。综上,本研究基于sRNA调节基因及分子伴侣工程等基因工程策略,提高了大肠杆菌的正丁醇耐受性,并通过ARTP随机诱变技术与生物信息学分析为筛选大肠杆菌正丁醇耐受性的元件及大肠杆菌宿主菌的表型改造提供了理论依据。
【图文】：

过程图,随机诱变,过程

图 2-1ARTP 随机诱变过程Fig. 2-1 Process ofARTP random mutagenesis（2）诱变菌的传代驯化：经 ARTP 诱变后的后培养菌液在均匀涂板后待长出单菌落，用液体营养肉汤培养基将菌落从固体平板上洗脱至摇瓶（50 mL）中，150 r·min-1振荡培养 6 h，再加入适量浓度的正丁醇，继续培养 18h 后以 1.5%（v/v）的接种量进行转接传代。每个正丁醇浓度传代转接 5-10 轮，起始正丁醇浓度为 4g·L-1，最后通过根据式 2.3 计算它们的比生长速率，对最终的驯化菌株进行正丁醇耐受性的比较。2.2.11 诱变驯化菌的基因组重测序及数据分析本研究中利用 Illumina HiSeq 测序平台进行全基因组重测序，根据制造商所给方案进行二代测序样品库的构建。首先对基因组 DNA 序列随机切断，得到小于 500bp 的片段，用 End Prep Enzyme Mix 处理片段进行末端修复，使其在一个反应中同时进行 5'磷酸化和 dA 加尾，最后通过 T-A 连接来在两端添加衔接子。使用 AxyPrepMagPCRClean-up（Axygen）对衔接子修饰后的 DNA 片段进行分离纯化，从中回收长度约 410bp 的片

耐受性,过表达,正丁醇,菌株

图 3-2 异源 secB 基因过表达时对大肠杆菌正丁醇耐受性的影响Fig. 3-2 n-Butanol tolerance of E. coli in overexpression of heterologous secB genes接着通过实验验证 2.2.3 中单基因过表达时的正丁醇耐受性，，由于 SDS-PAGE 分析发现在 ffh（62kDa），rpoH（39kDa），stpA（18kDa）和 sgrs（9kDa）基因过表达菌株中未发现明显表达条带，因此并未对其耐受性进行深入研究（图 3-3）。其它基因过表达菌株的正丁醇耐受性结果如图 3-4 所示，在添加 8 g·L-1正丁醇时，发现基因 groS，rpoS，asr，acrR，cspD，groL，clpB，nusB，grpE 和 proQ 的过表达能够提高重组菌株的正丁醇耐受性。相比于对照菌株 JM109/pQE80L，其中 AcrR，NusB，ClpB，ProQ 的过表达能够将耐受性提高近 2 倍（图 3-4A，3-4B，3-4C），而 GroL 和 GroS 的过表达仅仅提高了约 25%（图 3-4D，3-4E），其中正丁醇耐受性提高最显著的是 RpoS 的过表达菌株，耐受性提高了近 4 倍（图 3-4E），其中 Asr，GrpE，CspD 的过表达菌株的正丁醇耐受性提高不显著，而 Fur，Hfq，SugE，CspC 的过表达菌株的正丁醇耐受性并无提升。综上，相比于菌株 JM109/pQE80L-Ec-secB，其中只有 RpoS 的过表达能够与其媲美。0 2 4 6 8 10 12时间/ h
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q939.9

【相似文献】