牛AAMDC基因选择性多聚腺苷酸化及其转录后调控机制研究

发布时间：2020-05-14 09:07

【摘要】：转录后调控,包括mRNA的加工、转运、定位、转换以及翻译,是调控基因表达的重要环节。最近几年,越来越多的证据表明选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)通过产生不同长度3’UTR(3’untranslated region,3’UTR)变异体,在转录后水平调控基因表达。APA对mRNA的定位、稳定性及翻译效率有重要影响。牛AAMDC(Adipogenesis associated Mth938 domain containing)基因位于29号染色体上,包含4个外显子,编码122个氨基酸,结构域分析表明AAMDC包含一个Mth938结构域。该结构域是由热自养甲烷杆菌基因组编码的一种未知蛋白结构域,其功能尚未明确。目前影响AAMDC基因的转录后调控事件也有待阐明。本研究利用3’RACE对牛AAMDC基因变异体进行了克隆与鉴定。首先,通过双荧光素酶实验探究AAMDC不同的3’UTR对蛋白表达的影响。其次,构建并转染表达载体,检测不同的3’UTR对mRNA稳定性及翻译效率的影响。然后,利用Western blot和qRT-PCR方法进行了AAMDC基因与microRNAs(miRNAs)相互作用的探究。最后,分析了AAMDC长短变异体在牛前脂肪细胞分化过程的表达谱及其对牛前脂肪细胞分化的影响。主要研究结果如下:(1)通过APA和可变剪接(Alternative splicing,AS),牛AAMDC基因产生三种不同的变异体。其GenBank登录号分别为:MK576046,MK576047和MK576048。(2)双荧光素酶实验表明AAMDC长短3’UTR有不同的调控能力,短3’UTR能够促进蛋白表达。(3)将过表达载体转染到HEK293细胞中,qRT-PCR和Western blot结果表明短变异体的mRNA稳定性及翻译效率显著高于其他变异体。(4)miR-2428和miR-664a能够直接与长变异体的3’UTR结合并抑制其表达,表明由APA介导的3’UTR变短使AAMDC短变异体缺少了miR-2428和miR-664a的结合位点,从而逃避了miRNA的抑制作用。(5)利用qRT-PCR分析了AAMDC长短变异体在牛脂肪细胞分化过程中的表达谱,结果表明随着脂肪分化,AAMDC长短变异体及长变异体的表达量不断增高。将长短变异体转染到牛前脂肪细胞中,油红O染色和qRT-PCR结果表明AAMDC短变异体能够促进牛前脂肪细胞分化。总之,本研究阐明了一个新的由APA和miR-2428和miR-664a调节AAMDC的转录后调控机制。同时表明AAMDC短变异体能够促进牛前脂肪细胞分化,为进一步探究AAMDC的生理功能和脂肪生成的机制提供了坚实的理论基础。
【图文】：

变异体,事件,编码能力,多聚腺苷酸化

图 1-1 mRNA 3’末端加工机制[8]Fig. 1-1 mRNA 3’end processing machinery代测序技术的发展，人们发现选择性多聚腺苷酸化现象普遍存多个 poly（A）位点，产生不同编码能力或不同 3’UTR 的转人类基因能够利用 APA 产生 mRNA 变异体，果蝇、线虫、斑基因存在 APA 事件[1,8-11]。APA 事件主要存在两类：UTR-APA（native polyadenylation，UTR-APA）和 CR-APA （coding regtion，CR-APA）（图 1-2）。在 UTR-APA 事件中，PAS 位于 mRN生包含不同长度 3’UTR 但编码同一蛋白质的变异体。因为 3A 结合蛋白（RNAbinding proteins，RBPs）和 miRNAs 的结合的改变，UTR-APA 可能会使 mRNA 定位、稳定性及翻译效率PA，PAS 位于 mRNA 的内含子或外显子中，因此 CR-APA 能。综上所述，UTR-APA 能够在数量上影响基因表达，而 CR

示意图,示意图,异构体,时空调控

图 1-2 UTR-APA 和 CR-APAmRNA 示意图[8]Fig. 1-2 Schematic illustration of UTR-APAand CR-APAof mRNA.注：外显子用矩形表示；内含子用细线表示。te: Exons are represented by rectangular squares; Introns are represented by 在 mRNA 定位、稳定性和翻译效率中的功能A 定位的调控定位是细胞时空调控机制的关键，，结合到 3’UTR 元件的 RBP使 mRNA 定位到不同的亚细胞区室。APA 产生的不同 3’UTR位能力。脑源性神经因子（brain-derived neurotrophic factor，B因子，在树突发生和突触可塑性的活性依赖形式中发挥作用。作用下产生选择性 3’UTR 异构体，短的 3’UTR 异构体将 BDN
【学位授予单位】：聊城大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

【参考文献】