拟南芥高光效基因AtNRPC1的生物学功能研究

发布时间：2020-05-18 11:11

【摘要】：自然界中,光合作用是万物生长的能量来源,它能利用太阳能将无机物转变为有机物,为生物体代谢所使用。本实验室前期获得了一个水稻高光效nrpc1(negative regulator of photosynthesis and chloroplast development 1)的突变体,该突变体的叶、穗都呈现出深绿表型,光合效率增强,对该基因的机制已经有一定的研究基础。利用同源比对,从拟南芥中扩增得到了NRPC1基因的同源基因AtNRPC1,然后购买了相应的突变体与过表达转基因株系。将获得的突变体及过表达植株进行鉴定从而获得纯合的突变体和高表达的过表达株系,然后将其作为本实验的研究材料。本实验中主要利用叶绿素含量测定、光合速率测定、原生质体观察、叶绿体亚显微结构观察、酵母双杂互作分析、双荧光素酶报告系统分析、RNA-seq分析、Western-Blot等实验技术,对AtNRPC1基因的功能进行探究。结果如下:(1)atnrpc1突变体、野生型Col-0、过表达植株AtNRPC1-OE莲座叶中,atnrpc1的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均显著升高,均提高约40%;AtNRPC1-OE过表达株系的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均显著降低;在角果中存在相同现象,atnrpc1的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均显著升高;AtNRPC1-OE过表达株系的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量较Col-0均显著降低。(2)光系统Ⅱ的最大光化学效率(Fv/Fm)、净光合速率(Pn)的测定,atnrpc1的Fv/Fm、Pn均较Col-0提高了分别为2.7%、21%;AtNRPC1-OE过表达株系的的Fv/Fm、Pn均较Col-0降低了分别为3.4%、30%。(3)提取生长三周的atnrpc1、Col-0、AtNRPC1-OE植株叶片原生质体进行观察,atnrpc1的叶绿体较Col-0大,而AtNRPC1-OE的叶绿体较Col-0小;同时取三个植株的莲座叶进行电镜切片观察叶绿体的亚显微结构,突变体atnrpc1中叶绿体分布较密集,叶绿体形态较大且类囊体垛叠成基粒,叶绿体结构较发达;过表达AtNRPC1-OE中叶绿体个体最小且内囊体堆集较薄,基粒片层化。(4)对生物量鲜重、生物量干重、角果数量、千粒重进行测定,atnrpc1中以上指标均较Col-0显著增加,达到36%、47%、16%、11%;AtNRPC1-OE中以上指标均较Col-0显著降低。(5)对atnrpc1、Col-0、AtNRPC1-OE植株进行抽薹天数统计,atnrpc1的抽薹时间增加,较Col-0延迟两天,AtNRPC1-OE的抽薹时间减少,较Col-0提前三天。(6)对AtNRPC1基因的组织特异性表达进行分析,其主要在莲座叶、茎生叶以及角果中表达,在其它组织中表达量较低甚至不表达;同时该基因的表达还受到光周期的影响,且在光照6h时达到峰值。(7)AtNRPC1基因亚细胞定位主要在细胞核以及细胞质中表达。(8)水稻中已经通过酵母文库筛出NRPC1的互作蛋白GLKs,为了分析AtNRPC1与AtGLKs是否存在互作关系,构建酵母双杂载体。AtNRPC1与AtGLKs存在互作关系,但是AtNRPC1与AtGLK2的互作较弱。(9)在拟南芥原生质体中利用双荧光素酶系统检测AtGLK1、AtGLK2、AtNRPC1转录因子对光合相关基因启动子的调控作用,发现AtNRPC1能够抑制AtGLK1对光合相关基因启动子Lhcb2、Chl27的转录活性。(10)利用RNA-seq技术对AtNRPC1下游基因进行分析,拟对atnrpc1、Col-0、AtNRPC1-OE的共有差异基因进行筛选,筛出上调或下调基因共115个,通过GO分析及KEGG分析筛出开花相关基因(例如AG、FLC、SPL15等)及叶绿素代谢相关基因。(11)对部分光合及叶绿素合成相关基因表达量进行验证,结合Western-Blot结果,得到Lhca1、Lhcb2、PsaD、POR等在atnrpc1中的表达量较野生型显著性增加,蛋白水平结果一致;在AtNRPC1-OE中以上基因表达量均较野生型显著性下降,蛋白水平结果一致。(12)对上述RNA-seq筛选到的开花基因进行验证,得到AG、FLC、AGL42、SPL15、SEP1、TCP1共6个开花相关基因符合实验中过表达植株开花提前的现象。(13)构建AtGLKs-OE/Col-0、AtGLKs-OE/AtNRPC1-OE转基因植株,AtGLK1-OE/Col-0以及AtGLK1-OE/AtNRPC1-OE的开花时间与对照相比均延长。综上所述,AtNRPC1基因突变,导致下游光合相关基因的表达量及蛋白积累量发生显著变化,同时叶绿体发育也受到影响。同时AtNRPC1基因对花的发育过程也存在影响。这些结果对研究AtNRPC1基因的分子机理及植物的高光效奠定了基础。
【图文】：

图 1.1：叶绿素 a 合成机理图[21]Fig1.1: Chlorophyll a synthesis mechanism diagram2.1.2 叶绿素循环在叶绿素 b 的形成上，主要进行的是原脱植基叶绿素 a 向原脱植基叶绿素 b转变，也有一部分叶绿素 b，是叶绿素 a 在叶绿素 a 加氧酶（CAO）的催化下接发生转变的。叶绿素 b 也能在叶绿素 b 还原酶（CBR）、羟基叶绿素 a 还原（HAR）催化下再次转变为叶绿素 a。此后的研究发现叶绿素 b 还原酶是两种同的短链，分别称为 NON-YELLOW COLORING1（NYC1）和 NYC1-LIKENOL），这两种蛋白以异聚肽的形式形成复合物，催化叶绿素 b 还原。这种原植基叶绿素 a 与原脱植基叶绿素 b，或叶绿素 a 与叶绿素 b 的互相转变，称为绿素循环[27,28],如图 1.2 所示:

图 1.2 叶绿素的循环[28]Fig1.2 Chlorophyll cycle1.2.1.3 叶绿素的降解叶绿素降解机理因其所处环境的不同而异，长时间受光辐射、黑暗诱导、组织衰败、果实成熟、逆境胁迫等均会引起叶绿素降解。在叶片衰老过程中叶绿素不断分解, 导致叶绿素和类胡萝卜素的比例发生变化而使叶片呈现出黄色,。叶绿素的降解可以大致分为两个部分：（1）有色组件转化成初级荧光叶绿素代谢物（pFCC）；（2）pFCC 经非酶促异构化修饰，转化为非荧光叶绿素分解代谢物（NCC），被运至液泡进一步降解为单吡咯[31,32]。叶绿素 a 在脱镁螯合酶作用下释放中心 Mg 原子，，生成脱镁叶绿素 a。脱镁叶绿素 a 在脱镁叶绿素酶（PPH）的催化下脱去植醇，生成脱镁叶绿酸 a。体外
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2

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本文编号：2669627