裙带菜编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的cDNA克隆及其功能的初步研究

发布时间：2020-05-20 23:51

【摘要】：在自然界中,岩藻黄素占海藻中类胡萝卜素总产量的10%以上,具有多种生物活性。但是在褐藻中岩藻黄素的生物合成途径的多步反应尚不清楚,合成代谢途径中一些关键酶的编码基因研究也不多。本研究采用RT-PCR和5'/3'RACE的方法,从褐藻裙带菜(Undaria pinnatifida Suringar)组织中获得了编码ζ-胡萝卜素去饱和酶(ZDS)的cDNA,命名为UpZDS基因,该酶是催化链孢红素和番茄红素形成的关键酶。UpZDS基因全长的cDNA包含一个长度为1821 bp的开放式阅读框(ORF),编码606个氨基酸残基组成的蛋白。生物信息学分析结果显示,在该蛋白N末端存在一个大小为51个氨基酸残基的叶绿体转运肽,氨基酸序列中存在甘氨酸富集区(Gly-rich sequence),同时序列中还包含一个NAD/FAD结合域,同源性分析表明,UpZDS蛋白与其他植物的ZDS具有高度的保守性。本研究中将该开放阅读框克隆并连接到表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-28a-UpZDS,转化至E.coli BL21(DE3)构建工程菌,IPTG诱导工程菌高效表达重组ζ-胡萝卜素去饱和酶。大肠杆菌的基因遗传互补实验结合高效液相色谱分析(HPLC),验证了UpZDS基因所编码的蛋白具有ζ-胡萝卜素去饱和酶(ζ-carotene desaturase)的活性。同时表达UpZDS、crtE、crtB和crtP的大肠杆菌工程菌能产生链孢红素和番茄红素。此外,本实验中还考察了同时转化了crtE、crtB、crtP和UpZDS基因的大肠杆菌工程菌,在三个单因素条件下,产番茄红素、链孢红素和ζ-胡萝卜素这三种类胡萝卜素的情况。这三个单因素条件分别是不同的接种量,不同的IPTG浓度和不同的诱导温度。结果表明,在不同的接种量、不同的IPTG浓度和不同的温度下,大肠杆菌工程菌产三种类胡萝卜素情况始终是ζ-胡萝卜素最高,链孢红素第二,番茄红素最少。在接种量为唯一变量单因素实验中,番茄红素在接种量为1%时,其浓度达到最高,为0.637μg/mL。链孢红素和ζ-胡萝卜素在接种量为3%时,浓度达到最高,分别为2.182μg/mL和2.820μg/mL。在IPTG浓度为唯一变量的单因素实验中,番茄红素在IPTG浓度为0.5 mmol/L时达到最高值为0.691μg/mL。链孢红素和ζ-胡萝卜素均在IPTG浓度为0.7 mmol/L时达到最大值,分别为2.156μg/mL和2.392μg/mL。在温度为唯一变量的单因素实验中,番茄红素、链孢红素和ζ-胡萝卜素均在温度为20℃时,浓度达到最大值,分别为0.727μg/mL、2.301μg/mL和3.744μg/mL。本研究为阐明褐藻岩藻黄素的生物合成途径奠定了基础。
【图文】：

电泳图,裙带菜,电泳

图 1.1 提取的裙带菜总 RNA 电泳结1:裙带菜总 RNA；M: 5K DNA Markrophoresis of total RNAs in U. pinnaAs from U. pinnatifida Suringar; M:

去饱和酶,裙带菜,胡萝卜素

图 1.2 裙带菜编码ζ-胡萝卜素去饱和酶全长 cDNA 的克隆。DS 基因的 cDNA 部分片段的扩增。M: 5K DNA Marker； 1: UpZDS 基因的 cDb) UpZDS 基因的 cDNA 的 5'-RACE。M: 5K DNA Marker; 1: 5'-RACE 第一轮 E 第二轮 PCR。c) UpZDS gene cDNA 的 3'-RACE。M: 5K DNA Marker; 1: 3 PCR; 2：3'-RACE 第二轮 PCR。d) UpZDS 基因的 cDNA 中 ORF 的扩增。M:
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2

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