中间锦鸡儿豆荚颜色形成的代谢调节机制及两个相关基因功能分析

发布时间：2020-05-20 22:41

【摘要】：中间锦鸡儿(Caragan intermedia)是豆科锦鸡儿属植物,其花和根具有良好的治疗功效,均可入药;含有多种代谢产物,其中类黄酮化合物含量丰富。中间锦鸡儿豆荚呈现红色、绿色等不同颜色。本研究采用液质联用技术(LC-MS)检测了中间锦鸡儿不同颜色豆荚的代谢产物组成,系统研究了差异代谢产物的积累模式,分析了豆荚颜色形成可能的代谢调节机制,并对苯丙烷代谢途径中的重要酶——查尔酮合成酶(CHS)和白藜芦醇合成酶(RS)基因进行了克隆分析,对其功能进行了初步研究。具体结果如下:1.采用LC-ESI-MS/MS技术建立了中间锦鸡儿不同生长时期红色和绿色豆荚的代谢组,共检测到557个代谢产物,其中包括348个已注释的代谢产物,共筛选到36个含量差异明显的代谢产物,其中类黄酮11个。2.红色豆荚中总黄酮和原花青素含量明显高于绿色豆荚。调查了中间锦鸡儿红、绿豆荚的昆虫取食率,发现绿色豆荚的昆虫取食率高于红色豆荚,推测是由其类黄酮含量不同引起的。3.对中间锦鸡儿豆荚的代谢产物进行了多元分析,结果表明红、绿豆荚在代谢产物水平存在很大差异,代谢产物积累具有很强的发育时期特异性及颜色特异性。红、绿豆荚差异明显的初级代谢产物主要是氨基酸和核苷酸衍生物,次级代谢产物主要是类黄酮、酚胺和多酚类物质。类黄酮是最主要的差异代谢产物。红色豆荚中类黄酮途径代谢产物含量明显上调。红、绿豆荚不同发育时期主要的差异代谢产物为核苷酸衍生物和植物激素类。4.KEGG代谢途径富集分析显示30日龄红、绿豆荚的代谢产物主要包含在21条代谢途径中,其中4条有显著差异。不同发育时期绿色豆荚的代谢产物分布在33条代谢途径中,其中有10条差异明显的代谢途径;不同发育时期红色豆荚的代谢产物包含在32条代谢途径中,其中有7条差异明显的代谢途径。中间锦鸡儿豆荚的莽草酸代谢途径和植物激素代谢途径最活跃、代谢产物种类最多。5.利用简并引物和RACE技术从中间锦鸡儿中克隆得到苯丙烷代谢途径的两个重要基因CiCHS和CiSS,分别编码391和393个氨基酸,并对这两个基因的系统进化关系进行了分析。利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测,发现CiRS基因的表达受到干旱、NaCl、紫外等胁迫诱导。6.构建了 pCanG-CiCHS植物过表达载体,采用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥获得过表达植物。过表达CiCHS基因抑制了拟南芥自身AtCHS基因的表达,但过表达株系的总黄酮含量明显增加、柚皮苷含量增加。过表达株系对紫外胁迫的耐受性明显提高、膜脂氧化程度降低、清除自由基的能力明显提高。CiCHS基因互补拟南芥tt4突变体后,转基因植物种子的种皮呈现浅棕色,部分恢复了tt4突变体的表型。7.构建了 pCanG-CiRS植物过表达载体。过表达CiRS基因抑制了拟南芥自身AtCHS基因的表达,造成转基因拟南芥总黄酮含量的显著降低,但在过表达株系中检测到了白藜芦醇。过表达株系对紫外胁迫的耐受性增强、膜脂氧化程度降低、清除自由基的能力增加。
【图文】：

谱系,合酶,黄酮

中间锦鸡儿豆荚颜色形成的代谢调节机制及两个相关基因功能分析生成黄酮、花青素和异黄酮等代谢物的重要中间产物。黄酮醇合成类黄酮与儿茶素合成途径的桥梁，催化黄酮羟基化，生成黄酮醇类。原酶（ＤＦＲ）是花青素合成途径的起始点和关键酶逡逑合成酶逡逑合成酶（Ｃｈａｌｃｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，邋ＣＨＳ，邋ＥＣ．邋２．３．１．７４）是查尔酮合酶超基因聚酮合酶（Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅｓ，邋ＰＫＳ）超基因家族的核心成员［９２１，３［９３］。研究认为ＣＨＳ最早出现于陆地植物和藻类植物分开之后，苔藓。在进化过程中，由于全基因组加倍、特异的谱系扩张、染色体片制、转座子复制、可能的拷贝丢失以及功能分歧等方式，逐步生成ＨＳ－ｌｉｋｅ）蛋白，如ＳＴＳ邋（苗合酶，Ｓｔｉｌｂｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＢＡＳ邋（苯亚甲ｅｎｚａｌａｃｅｔｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＣＳ邋（Ｐ丫陡酮合酶，Ａｃｒｉｄｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）、，Ｂｉｂｅｎｚｙｌ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）、２ＰＳ邋（２－卩比喃酮合酶，２－ｐｙｒｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）等

豆荚,样品,中间锦鸡儿,绿豆

经初步分析发现，结荚后１０天、２０天和３０天的豆荚样品在各个方面均存逡逑在较大差别，因此对这三组样品进行了代谢组检测。实验所用红色豆荚和绿色豆荚逡逑的样品见图６。豆荚采摘后，将其剥开，迅速弃去其中的豆子，只留下豆荚皮用于逡逑代谢组检测，并立即置于液氮中进行速冻。每个样品为２０个随机采摘豆荚的混合样逡逑品，每个样品设三个生物学重复。逡逑Ｇ１逦Ｇ２邋Ｇ３邋Ｇ４邋Ｇ５邋Ｇ６逡逑Ｉ邋Ｓ邋１１邋；邋１逡逑」？邋ｍ、逡逑Ｒ１邋Ｒ２逦Ｒ３逦Ｒ４邋Ｒ５邋Ｒ６逡逑图６实验用中间锦鸡儿红、绿豆荚样品逡逑图中样品分别为：Ｇ１，邋Ｒ１：结荚后３０天的豆荚；Ｇ２，邋Ｒ２：结荚后２５天的豆荚；Ｇ３，邋Ｒ３：结荚后２０天的豆荚；逡逑Ｇ４，Ｒ４：结荚后１５天的豆荚；Ｇ５，Ｒ５：结荚后１０天的豆荚；Ｇ６，Ｒ６：结荚后５天的豆荚。逡逑Ｆｉｇ．邋６邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋ｏｆ邋ｇｒｅｅｎ邋（ｔｏｐ）邋ａｎｄ邋ｒｅｄ邋（ｂｏｔｔｏｍ）邋ｐｏｄｓ邋ｏｆ邋Ｃａｒａｇａｎａ邋ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ逡逑Ｔｈｅ邋ｓａｍｐｌｅ邋ｐｏｄｓ邋ａｒｅ邋ａｓ邋ｆｏｌｌｏｗｓ：邋ＧＩ，邋Ｒ１：邋３０－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ；邋Ｇ２，邋Ｒ２：邋２５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ；邋Ｇ３，邋Ｒ３：邋２０－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ；邋Ｇ４，，邋Ｒ４：逡逑１５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ；邋Ｇ５，邋Ｒ５：邋１０－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ邋ａｎｄ邋Ｇ６，邋Ｒ６：邋５－ｄａｙ－ｏｌｄ邋ｐｏｄｓ邋ａｆｔｅｒ邋ａｎｌｈｅｓｉｓ．逡逑２．邋２．邋２．邋２样品制备与提取逡逑将液氮速冻后的豆荚样品进行冷冻干燥
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943;Q945

【参考文献】