携带GSDME基因的溶瘤腺病毒构建及其抑制肝癌细胞生长的研究

发布时间：2020-05-20 13:45

【摘要】：目前肝癌的发病率和死亡率逐年上升。在中国,肝癌在男性和女性癌症患者中的死亡率分别居第二和第三位,且肝癌治疗之后容易复发和转移,因此寻找新的治疗肝癌方法刻不容缓。细胞焦亡是一种新的细胞死亡方式,GSDME基因是细胞焦亡的重要基因,也是一种抑癌基因。为探索GSDME基因在肝癌靶向治疗中的作用,利用实验室先前构建的GP73调控的溶瘤腺病毒GD55作为载体,构建了携带GSDME基因的溶瘤腺病毒GD55-GSDME,并进行了其单独或联合化疗药物Dox抗肝癌细胞生长的研究。本研究中,首先通过qRT-PCR、Western blot和免疫组化检测GSDME基因在肝癌细胞和临床肝癌组织中的本底表达;利用基因工程方法构建了携带GSDME基因的溶瘤腺病毒GD55-GSDME;通过MTT、LDH和结晶紫染色检测了 GD55-GSDME和Dox对肝癌细胞生长的影响;Western blot检测了 GD55-GSDME和Dox处理肝癌细胞后GSDME、GSDME-N和caspase3等蛋白表达量的变化;Hoechst33342和流式检测了 GD55-GSDME和Dox对细胞凋亡的影响;动物模型检测GD55-GSDME联合Dox对肝癌细胞生长的抑制作用。结果表明,GD55-GSDME和Dox联合处理肿瘤细胞时,细胞会并发细胞凋亡和细胞焦亡,而且Dox和病毒联合可以更多细胞发生焦亡,比任一单一处理更有效抑制肝癌细胞生长。综上,我们构建了 GP73启动子调控且携带GSDME基因的新型溶瘤腺病毒GD55-GSDME,在体内外能特异性靶向肝癌细胞并抑制肝癌细胞的生长,与Dox联合具有较好的协同效应,并且对正常细胞的影响较小。进一步发现,溶瘤腺病毒GD55-GSDME联合Dox能引起肝癌细胞凋亡和细胞焦亡,更加有效地抑制和杀伤肿瘤细胞,有望为肝癌的临床治疗提供新思路和新技术。
【图文】：

３．１．１逦ｐＣＡ１３－ＧＳＤＭＥ重组质粒构建与鉴定逡逑利用Ｉ和／／／？ｄ邋ＩＩＩ分别将ｐＣＡ１３质粒和ｐＣＳ２－ＧＳＤＭＥ进行双酶切，酶切后进行逡逑连接和转化。对转化产物进行酶切鉴定，电泳图如图３．１，明显可以看到，泳道１、２和３逡逑在１５００邋ｂｐ处皆有一条带，与基因大小相符；上面７０００邋ｂｐ有一条带与ｐＣＡ〗３载逡逑体大小相符，说明ＰＣＡ１３－ＧＳＤＭＥ质粒构建重组成功。逡逑Ｍ邋１逦２逦３逡逑５０００ｂｐ逡逑ｉ５00ｂｐ逦＾逡逑ｌＯＯＯｂｐ逡逑５００ｂｐ逡逑图３．１邋ｐＣＡ１３－ＧＳＤＭＥ质粒酶切鉴定图逡逑Ｆｉｇ邋３．１邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐＣＡ１３－ＧＳＤＭＥ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｂｙ邋ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ逡逑Ｍ：邋１５０００邋ｂｐ邋Ｍａｒｋｅｒ；泳道１、２、３为转化产物逡逑３．１．２逦ｐＧＤ５５－ＧＳＤＭＥ重组质粒构建与鉴定逡逑分别利用单酶切ｐＣＡ１３－ＧＳＤＭＥ和ｐＧＤ５５质粒，酶切后做连接和转化。对转逡逑化产物进行酶切鉴定，电泳如图３．２所示，４个泳道在１５００邋ｂｐ处皆有一条带，为ＧＳＤＡｆｆｉ逡逑基因大小；在１００００匕口左右也有一条带，显示为卩００５５质粒大小，证明卩００５５－０５０＼＾逡逑质粒重组成功。逡逑２６逡逑

Ｆｉｇ邋３．２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐＧＤ５５－ＧＳＤＭＥ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｂｙ邋ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ逡逑Ｍ：邋１５０００邋ｂｐ邋Ｍａｒｋｅｒ，，泳道邋１、２、３、４邋为转化产物逡逑因组的构建与鉴定逡逑ＰＧＤ５５－ＧＳＤＭＥ质粒用Ｐｍｅ邋Ｉ酶切线性化，去磷酸化后转化，用Ｋａｎ平板筛选，挑取单克隆，抽提质粒进行酶切鉴定，再Ｉ酶对转化产物进行酶切鉴定，如图３．３所示，４个泳道均有５条ｂｐ、４８００邋ｂｐ、７０００邋ｂｐ和２００００邋ｂｐ左右，说明同源重组质粒构Ｍ邋１逦２逦３逦４逡逑１５０００ｂｐ逦■邋’逡逑ｌＱＯＯＯｂｐ＾＾ｌＫ邋ｓ；邋ｉ－逦＾逡逑ＳＯＯＯｂｐ＾＾Ｒ１，邋＇邋＾逦￡邋Ｊ邋哢逡逑１５００ｂｐ｜逡逑ｌＯＯＯｂｐｌ逡逑５００ｂｐ邋Ｉ逦｜逡逑
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R735.7;Q78

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本文编号：2672708