青海沙蜥对高原低氧和低温适应性的转录组学研究

发布时间：2020-05-22 06:24

【摘要】：青藏高原是世界上最高的高原,素有世界屋脊之称。高原环境具有低氧、低温及强紫外线等特点,对动物来讲是一种挑战。世居高原的动物经过自然选择,从表型到遗传,从生理到分子机制,已经进化出各自独特的高原适应机制。鬣蜥科沙蜥属青藏高原特有物种青海沙蜥(Phrynocephalus vlangalii),经过世代演变,已经很好地适应了高原环境。本研究中,我们以世居高原的青海沙蜥玛多种群(4270米)和德令哈种群(2862米)为研究对象,利用RNA测序技术对青海沙蜥玛多和德令哈种群的不同发育阶段(幼体和成体)进行了种群间和发育阶段间的比较转录组学研究,筛选差异表达基因(DEGs)并进行GO和KEGG的功能注释分析,寻找关键的代谢通路及调控基因,并进行生理生化层面的验证,以期更为深入地探究爬行动物的高原适应性及其调控机制。对青海沙蜥成体和幼体高低海拔种群共计12个样品进行转录组测序、组装及过滤后,共获得84.05Gb Clean data,Q30碱基百分比在90.64%及以上;经Trinity合并组装后共获得96348条Unigene,其中N50为1852bp;对Unigene进行功能注释,包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、KOG、eggNOG、GO和Pfam数据库的比对,共获得19947条Unigene的注释结果。将四组样品分别进行成对比较,以FDR0.01且FC≥2为标准筛选样品间DEGs,探索基因的表达模式并进行功能注释和代谢通路的分析。采用生理生化的方法对能量代谢的关键代谢酶和物质进行了测定,结合转录组与生理生化的方法探究青海沙蜥不同种群及不同发育阶段的高原适应性。在幼体阶段,我们发现有688条基因在德令哈种群与玛多种群间存在差异,这些DEGs被注释到60个GO条目中,并在分子伴侣依赖的蛋白质折叠(GO:0051085)、氧气结合(GO:0019825)、氧化应激响应(GO:0006979)以及ATP分解(GO:0006200)等条目中得到显著富集。DEGs共涉及78条KEGG代谢通路,经富集分析后筛选出一条富集代谢通路即脂肪酸代谢通路(ko01212)。其中参与脂肪酸合成的基因(如ACC2和SCD)在玛多种群中显著上调,参与脂肪酸氧化的基因(如CPT1)显著下调。代谢酶活性与物质含量测定的结果显示玛多种群具有较低的HOAD的活性及较高的总胆固醇含量。转录组与酶活性的实验结果说明高海拔的青海沙蜥幼体更倾向于脂肪的合成与贮存。在成体阶段,我们发现有2223条基因在德令哈和玛多种群间存在差异,这些基因被注释到54个GO条目中,其中ERK1和ERK2级联调节过程(GO:0070372)、电子载体活性(GO:0009055)及血红素结合(GO:0020037)等条目得到显著富集。这些DEGs共涉及185条KEGG代谢通路,其中神经活动配体受体相互作用(ko04080)及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(ko00400)等通路的富集程度较高。参与脂肪酸降解(如ACAT2与AOX1)和氨基酸生物合成(TAT、ARG2及ASS1)等代谢通路的基因在高海拔种群中表达量上调;酶活性测定的结果显示高海拔种群具有较高的LDH和HOAD活性。这些结果表明高海拔的成体青海沙蜥更倾向于脂肪酸的分解来供能,这与唐晓龙等人在红尾沙蜥(Phrynocephalus erythrurus)和青海沙蜥中得到结果一致,提示上述特性可能在高原几种沙蜥中广泛存在。在德令哈种群中,成体和幼体共有1069条DEGs,这些基因被注释到41个GO条目中,其中免疫系统过程(GO:0002376)、细胞生长(GO:0016049)、补体激活途径(GO:0006957和GO:0006958)等条目得到显著富集。这些DEGs共涉及215条KEGG的代谢途径,其中矿物质吸收(ko04978)、溶酶体(ko04145)及氧化磷酸化(ko00190)等通路的富集程度较高。成体中脂肪酸合成相关的基因(ACC1、FAD6和SCD)的表达量上调,脂肪酸氧化相关的基因(CPTIB和ACAT1)的表达量下调,说明德令哈种群成体更倾向于脂肪的合成和积累;成体还上调了免疫系统过程相关的大部分基因,这种免疫系统的增强能够有效地防止微生物的侵害,更好地适应栖息地的复杂环境。在玛多种群中,成体和幼体间共有3019条DEGs,注释到GO的48个条目中,在糖酵解过程(GO:0006096)、免疫系统过程(GO:0002376)和生长因子活性(GO:0008083)条目得到富集;这些DEGs参与KEGG的184条代谢通路,其中氧化磷酸化(ko00190)、类固醇的生物合成(ko00100)和心肌收缩(ko04260)三条通路得到显著富集。与幼体相比,成体中脂肪酸合成的基因(FAD、ACC2、ACSL3及ELOVL等)的表达量下调,脂肪酸氧化的大部分基因(KCS及AOX1)的表达量上调。此外,成体还下调了氧化磷酸化(ND、NDUFS、SDHUFS2和COX等)和糖酵解(LDHA、LDHB和GAPDH等)相关基因的表达量,表明在发育中机体下调了氧化磷酸化和糖酵解的水平。这些结果表明与幼体相比,玛多种群在幼体到成体的发育过程中伴随着代谢底物偏好向脂肪酸的转化。我们还对青海沙蜥玛多种群冬眠前期、冬眠中期和冬眠觉醒期三个时期肝脏中的转录组进行了比较分析,筛选DEGs并进行聚类分析,筛选参与冬眠低温调控的关键代谢通路。转录组测定及过滤后共得到41.41Gb Clean data,Q30在94.48%及以上;经Trinity合并组装后共获得192696条Unigene;比对到七大数据库后,共得到26566条Unigene的注释结果;将三组样品进行两两配对比较,以FDR0.01且FC≥2为标准筛选DEGs,并进行基因功能的注释分析。结果显示,与其它两组相比,冬眠期青海沙蜥与脂肪酸代谢(ko01212)有关的基因都显著上调,而氧化磷酸化(ko00190)和糖酵解过程(ko00010)的大部分基因显著上调,提示其在冬眠过程中主要通过脂肪酸氧化的方式提供能量,这与马铁菊头蝠的冬眠的研究结果一致。青海沙蜥冬眠期还上调了免疫响应相关的基因(IL8、CXCL1及FHC)表达,保护机体免受细菌病毒的感染。同时还发现谷胱甘肽代谢(ko00480)通路中相关基因(GST和PHGSH-Px)在冬眠期也表达量上调,以避免氧化应激损伤。上述结果提示,青海沙蜥在冬眠阶段通过代谢、免疫与抗氧化防御等方面的调节,更好耐受并适应了冬眠期间的低温等极端环境。本论文从转录组学的角度阐明了青海沙蜥的高原适应和冬眠期低温适应方面的基因表达情况,筛选到了代谢、免疫及生长相关的关键基因和代谢调控通路,为后期生理生化角度的验证提供了参考和依据;另一方面丰富了青海沙蜥不同发育阶段及不同生理状态下的转录组数据资源,为后期的大规模数据分析提供了参考和利用信息。
【图文】：

长度分布,转录组,青海沙蜥,长度分布

26图 2.1. 青海沙蜥转录组样品组装后 Unigene 长度分布re 2.1. The length distribution of assembled unigenes in P. vla

青海沙蜥,火山,量差,对数

3 青海沙蜥德令哈和玛多幼体种群间差异表达基因的火山图（A）和 MA 图（点代表一个基因，红色的点代表上调基因，绿色的点代表下调基因，黑色的差异基因。A 图的横坐标：log2(FC)，，即两样品间基因表达量差异倍数的对数：-log10(FDR)，即错误发现率的负绝对值；B 图横坐标：log2(FPKM)，即样品均值的对数值；纵坐标为：log2(FC)，即两样品间基因表达量差异倍数的对数 2.3 Volcanno plot (A) and MA plot (B) of DEGs between the population of Delin
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q953

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