环境抗生素抑制土壤脲酶的毒性效应与机制研究

发布时间：2020-05-22 10:06

【摘要】：抗生素作为一大类高毒性、高残留的有机污染物已引起环境学者的广泛关注。抗生素进入土壤后会破坏原有土壤环境的稳定状态,并影响土壤功能酶的生物活性,打破土壤功能酶参与碳、氮、磷循环的平衡,进而对土壤功能造成严重的破坏。鉴于此,探究各类抗生素的毒性差异、阐明其毒性作用机制已成为环境研究领域内的热点问题。目前关于抗生素对土壤的污染现状已被广泛探讨,但有关抗生素对土壤功能酶活性的致毒作用仍缺乏系统的研究。同时,抗生素对土壤功能酶的分子致毒机制尚未阐明,制约了从本质上评价抗生素对土壤功能酶的污染机理。本研究选取土壤脲酶作为抗生素靶向目标,主要考察六类典型抗生素对土壤脲酶的毒性抑制和作用机制。通过分子毒性实验分别得到不同抗生素对土壤脲酶活性的致毒作用;借助传统荧光光谱和分子对接技术对抗生素与土壤脲酶复合物的结构进行解析;将理论模拟数据与实验结果相对照,阐明六类典型抗生素对土壤脲酶活性的毒性作用差异机制,建立评价抗生素生物毒性效应的新方法。主要研究工作如下:(1)首先,通过分子毒性实验考察六类典型抗生素对土壤脲酶活性的影响效果。喹诺酮类抗生素诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星和β-内酰胺类抗生素青霉素、头孢氨苄、阿莫西林对土壤脲酶活性的作用效果均整体表现为抑制作用(除环丙沙星对土壤脲酶活性无明显作用);四环素类抗生素四环素、土霉素、强力霉素对土壤脲酶活性的作用效果整体均表现为促进作用;除阿奇霉素对土壤脲酶活性表现出促进作用外,大环内酯类抗生素红霉素、克拉霉素、罗红霉,氨基糖苷类抗生素卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素和磺胺类抗生素磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑对土壤脲酶活性均无明显的作用效果。(2)接下来,通过荧光光谱技术考察六类典型抗生素与土壤脲酶的相互作用。实验结果表明六类典型抗生素与土壤脲酶的相互作用过程中,土壤脲酶的荧光强度具有明显的下降趋势,即抗生素与土壤脲酶发生了猝灭作用。结合分子毒性实验数据可推断六类典型抗生素与土壤脲酶相互作用的差异类型:喹诺酮类抗生素环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星和β-内酰胺类抗生素青霉素、头孢氨苄、阿莫西林于土壤脲酶的催化活性中心发生静态猝灭;四环素类抗生素四环素、土霉素和强力霉素于土壤脲酶的非催化活性中心发生静态猝灭;大环内脂类抗生素红霉素、克拉霉素、罗红霉素、环丙沙星,氨基糖苷类抗生素卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素和磺胺类抗生素磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶于土壤脲酶的非催化活性中心发生静态猝灭或动态猝灭。(3)最后,通过MOE分子模拟软件对六类典型抗生素与土壤脲酶进行分子对接,可以从毒物与土壤脲酶结合前后整体能量变化、结合面积、氢键、离子键作用层次对抗生素抑制土壤脲酶生物活性的差异机制进行阐释。结果表明:(1)喹诺酮类抗生素在土壤脲酶的催化活性中心与其结合形成复合物,对土壤脲酶活性产生明显的抑制作用。复合物整体结合面积和毒物毒性变化存在正相关性,可作为评价该类抗生素对土壤脲酶致毒机制的重要指标;喹诺酮类抗生素-土壤脲酶结合能量的变化应归结于氢键、离子键等相互作用,两者对接后整体能量下降程度与毒物毒性变化正相关,表明该能量变化值可作为评价该类抗生素毒性的重要指标;在喹诺酮类抗生素和土壤脲酶的相互作用中,O~(25)←Lys_(443)、C~6→Glu_(369)等氢键作用和N~4-Asp_(79)、O~(25)-Lys_(443)等离子键作用与毒物毒性变化正相关;O~(23)←Lys_(443)、N~4→Asp_(103)等氢键作用和N~4-Glu_(503)等离子键作用和毒物毒性变化负相关,即以上作用越强毒物对土壤脲酶抑制作用越小;环丙沙星与土壤脲酶形成的氢键、离子键作用对毒物毒性变化相关性较小;催化活性中心的两个Ni~(2+)对结合过程未发现明显的影响作用。(2)β-内酰胺类抗生素在土壤脲酶的催化活性中心与其结合形成复合物,对土壤脲酶活性产生明显的抑制作用。复合物的整体结合面积和毒物毒性变化存在正相关性,可作为评价该类抗生素对土壤脲酶致毒机制的重要指标;β-内酰胺类-土壤脲酶结合能量的变化应归结于氢键、离子键等相互作用,两者对接后整体能量下降程度与毒物毒性变化正相关,表明该能量变化值可作为评价抗生素毒性的重要指标;在β-内酰胺类抗生素和土壤脲酶的相互作用中,O~(63)←Lys_(443)、O~8←Asn_(46)等氢键作用和O~(13)-Arg_(94)、O~(13)-Arg_(52)等离子键作用等离子键作用与毒物毒性变化正相关;S~4←Gly_(368)、O~(18)→Asp_(79)等氢键作用和O~(62)-Lys_(124)、O~(63)-Arg_(518)离子键作用与毒物毒性变化负相关,即以上作用越强毒物对土壤脲酶抑制作用越小;催化活性中心的两个Ni~(2+)对结合过程未发现明显的影响作用。(3)四环素类抗生素在土壤脲酶的非催化活性中心与其结合形成复合物,由于四环素类抗生素与土壤脲酶非催化活性中心的相互作用导致其催化活性中心活性的改变,间接导致抗生素在土壤脲酶非催化活性中心对其产生促进作用。四环素类抗生素与土壤脲酶的整体结合面积和毒物毒性变化存在正相关性,可作为评价抗生素对土壤脲酶致毒机制的重要指标;四环素类-土壤脲酶结合能量的变化应归结于氢键、离子键等相互作用,两者对接后整体能量下降程度与毒物毒性变化正相关,表明该能量变化值可作为评价抗生素毒性的重要指标;在四环素类抗生素和土壤脲酶的相互作用中,O~3→Phe_(567)、N~(21)→Phe_(567)等氢键作用和N~4-Glu_(311)、N~4-Phe_(567)等离子键作用与毒物毒性变化正相关;C~4→Glu_(311)、O~1←Arg_(373)等氢键作用和N~4-Asp_(79)离子键作用与毒物毒性变化负相关,即以上作用越强毒物对土壤脲酶抑制作用越小。(4)氨基糖苷类、大环内脂类、磺胺类抗生素在土壤脲酶的非催化活性中心与其结合生成复合物,对土壤脲酶活性无明显作用效果。氨基糖苷类、磺胺类抗生素、大环内脂类(除阿奇霉素与土壤脲酶的整体结合面积、整体能量变化和毒物毒性有一定的相关性)与土壤脲酶的整体结合面积、整体能量变化和毒物毒性变化无相互作用效果;氨基糖苷类、大环内脂类、磺胺类抗生素与土壤脲酶结合生成的氢键作用、离子键作用对毒物毒性无明显的影响(阿奇霉素涉及的O~(4B)→Asp_(329)、O~(13)→Asp_(394)、C~(8A)→Glu_5、O~(2A)→Glu_5氢键作用和N~1-Glu_(45)、N~1-Asp_(258)离子键作用与毒物毒性变化有一定的的相关性)。
【图文】：

三维结构图,大分子,受体,配体

www.rcsb.org/pdb/home/home.do）[66]，PDB 代码为 1FWJ。利用 MO 种样品抗生素与土壤脲酶进行分子对接。分子孔洞技术（图 2-2）：软件及土壤脲酶。②MOE 界面，，点击右侧 QuickPrep/Minimied。③。MOE 界面，Compute-Site Finder...-Apply-选中合适的对接区域（10 条链）-Dummies-Yes-Close。④导入小分子。MOE 界面，File-Ope分子)-选中小分子。⑤对接。Compute-Dock...。分别得到 20 种样品脲酶的结合物。（在对接过程中，系统一般会自动筛选出对接最优可以通过对比分析每个结合物的相关参数来确定抗生素与土壤脲酶域。）

脲酶,复合物,诺氟沙星,恩诺沙星

of quinolones antibiotic - soil urease complex at different化活性中心面积占比催化活性中心结合面积占比非催化活性中心能量变化催化活心能量38% 55% -8.57534 -10.33% 52% -9.008 -11.132% 53% -10.46236 -13.128% 43% -7.60236 -10.3示，诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星键、离子键的作用为主，运用 MOE 软件的分子生素与土壤脲酶相互作用后的能量变化、结合面子键等作为评价诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星作用的重要参数。
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X171.5

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