灵芝漆酶的性质、应用及其基因在毕赤酵母中的表达

发布时间：2020-05-24 00:02

【摘要】：漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,其作用底物广泛且对环境无害,有着巨大应用潜力,但其大规模应用收到酶的经济性和效率的制约,性质优良的漆酶菌株的筛选和构建具有重要的价值和意义。论文以产漆酶菌株SYBC L48为研究对象,对其进行了分子鉴定,研究了其发酵产漆酶培养基组成、漆酶的分离纯化和酶学性质、漆酶在合成染料脱色中的应用,并对其漆酶基因进行了克隆和外源表达,主要结果如下:(1)对实验室保藏的一株产漆酶真菌进行了分子生物学鉴定,确定菌株SYBC L48属于灵芝属(Ganoderma)真菌,命名为Ganoderma sp.SYBC L48。优化后的产酶培养基为:蔗糖12 g·L~(-1)、豆粕6 g·L~(-1)、CuSO_4·5H_2O 0.5 mmol·L~(-1)、KCl 0.5 g·L~(-1)、KH_2PO_4 1g·L~(-1)、MgSO_4·7H_2O 0.5 g·L~(-1),MnSO_4·H_2O 0.01 g·L~(-1)。在优化后的培养基下,Ganoderma sp.SYBC L48漆酶酶活最高达2598 U·L~(-1),比优化前提高了35.1%。(2)经过硫酸铵分级沉淀、DEAE-FF离子交换层析两步纯化后得到了电泳纯的Ganoderma sp.SYBC L48漆酶蛋白,纯化倍数为13.2倍,回收率21.5%,分子量约为60kDa。纯化后漆酶的最适反应温度为60℃,温度稳定性较好,20~60℃保温1 h能保持80%以上的酶活力;最适pH为2.5,在pH 5.0~9.0范围内,25℃保温24 h仍能保持80%以上的酶活力;Co~(2+)、Cr~(3+)、Fe~(3+)对酶活力有抑制作用。以ABTS(2,2'-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))为底物时,K_m值为0.044 mmol·L~(-1)。(3)纯化后的漆酶酶液对活性亮蓝、酸性红1和孔雀石绿这3种染料的脱色效果明显,反应120 min后脱色率可分别达到76.6%、90.3%和58.1%。使用小麦种子和小球藻对染料及其漆酶降解产物的毒性进行了分析,结果表明酶处理后染料的毒性减弱。(4)扩增得到了Ganoderma sp.SYBC L48漆酶全长结构基因lac1和相应的全长cDNA序列。生物信息学分析表明lac1漆酶基因共编码525个氨基酸,其中前22个氨基酸被预测为信号肽序列,其编码的蛋白预测分子量为57.2 kDa(不包括糖基化),等电点为5.23。随后成功实现了lac1基因在毕赤酵母中的异源表达。
【图文】：

Trametes trogii 漆酶的晶体结构立体 Stereo view of Trametes trogii laccas漆酶-介体系统步骤：与漆酶结合，Ⅰ型铜离子从底物核铜离子中心(TNC)。从 T1Cu 传递的电子后，依次，Solomon 等提出了一个较为的残基，，显著降低了 T2Cu 和2Cu 被还原，T3Cub最后被还原还原为水。氧分子通过蛋白表水分子再由另一条水通道被释研究者们普遍同意在反应过程中

图 1-2 介体存在下漆酶催化底物氧化反应机理Fig. 1-2 Reaction mechanism of laccase catalytic oxidation with mediators用
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;Q814

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本文编号：2678154