MiR-34s对DNA损伤修复的调控作用及机制研究

发布时间：2020-05-30 13:08

【摘要】：目的:miR-34s作为抑癌基因已经被广泛研究和报道。这些研究主要是基于miRNA靶向抑制细胞周期、增殖、衰老、凋亡等过程中相关分子进而产生的效应。本研究是从上述事件的诱因考虑,主要探索miR-34s是否参与DNA损伤修复过程、引起DNA损伤的分子机制以及对DNA损伤的效应事件,例如:周期阻滞、增殖抑制以及细胞凋亡产生的影响。方法:(1)用miR-34s或阴性对照miR-NC模拟物分别转染HCT116、HT29、U2OS细胞,利用western blot检测DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)标志物γH2AX蛋白水平。然后给予HCT116细胞相同的处理,利用免疫荧光法检测γH2AX焦点(foci)以及彗星电泳法检测尾部DNA百分比。(2)用miR-34s或miR-NC模拟物转染HCT116细胞,利用流式细胞仪检测各组细胞周期分布(n=3)。(3)用miR-34s或miR-NC模拟物转染HCT116细胞,在倒置显微镜下密切观察细胞生长状态,利用CCK-8法(n=5)和克隆形成实验(n=3)检测细胞增殖与存活。(4)用miR-34s或miR-NC模拟物转染HCT116细胞,利用Annexin V-FITC/PI结合流式细胞仪检测凋亡细胞百分比(n=3)。(5)用miR-34c-5p或miR-NC模拟物转染HCT116细胞,利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测miR-34c-5p表达水平,利用western blot对HR和NHEJ修复相关蛋白进行检测。(6)DR-GFP/I-SceI HR修复报告质粒与miR-34a/b/c-5p或miR-NC模拟物共转HCT116细胞,利用流式细胞仪检测GFP~+细胞百分比(n=3)。(7)miR-34a/b/c-5p或miR-NC模拟物与RAD51过表达质粒pcDNA3.1-MYC-RAD51或阴性对照质粒pcDNA3.1-MYC共转染,利用western blot检测RAD51和γH2AX蛋白表达水平。(8)利用qPCR检测miR-34a/b/c-5p过表达后RAD51 mRNA表达水平。利用生物信息学分析miR-34s与RAD51mRNA潜在的结合位点,并利用双荧光素酶报告系统质粒进行验证(n=3)。(9)用miR-34a/b/c-5p或miR-NC模拟物分别转染HCT116 p53~(wt)和HCT116 p53~(-/-)细胞,利用western blot检测p53、RAD51和γH2AX的蛋白水平以及利用qPCR检测p53和RAD51的mRNA水平。结果:(1)转染后48 h,在HCT116、HT29和U2OS细胞中miR-34s组的γH2AX蛋白水平不同程度地上调,但这三种细胞的结果不完全一致。在免疫荧光实验和彗星电泳实验中,miR-34s家族除了miR-34b-3p,其它家族成员均能明显增加γH2AX焦点阳性细胞数(γH2AX焦点5)以及尾部DNA百分比。(2)于转染后48 h和72 h,miR-34s家族除了miR-34b-3p和miR-34c-3p,其它家族成员均能明显诱导细胞发生G1期阻滞并伴随着S期以及G2/M期细胞比例降低。(3)上调HCT116细胞中miR-34s水平后,细胞形态发生明显的改变,表现为:细胞由长梭形或多角形变为圆形或椭圆形,细胞表面变得粗糙,细胞之间黏连增多以及细胞密度明显减少。转染后24 h,在倒置显微镜下已经可以观察到组间差异,在转染后48 h和72 h,组间差异较为显著。细胞增殖检测以及细胞克隆形成实验均显示细胞增殖与存活能力明显受到抑制。上述结果中miR-34b-3p作用均较弱。(4)上调HCT116细胞中miR-34s水平,miR-34s组出现不同程度的细胞凋亡。于转染后48 h,除了miR-34a-3p和miR-34b-3p组,其它实验组凋亡水平均具有统计学差异。在转染后72 h,各实验组均可不同程度诱导细胞凋亡,差异具有统计学意义,其中miR-34a-3p和miR-34b-3p诱导细胞凋亡的能力较弱。(5)利用miR-34c-5p和miR-NC模拟物转染HCT116细胞,于转染后24 h和48 h,与miR-NC组相比miR-34c-5p组中miR-34c-5p表达水平上调约20倍,此外RAD51和PLK1蛋白水平均明显下调,其它HR修复和NHEJ修复相关蛋白表达水平也发生一定程度的变化,例如RAD50和DNA-PKcs Ser~(2056)蛋白表达水平增加,以及BCL2和LIG4蛋白表达水平降低。(6)过表达miR-34a/b/c-5p或转染si-RAD51均可明显抑制RAD51蛋白表达水平和GFP~+细胞百分比。GFP~+细胞百分比代表HR修复效率。(7)过表达RAD51可部分逆转miR-34a/b/c-5p诱导的高水平γH2AX。(8)qPCR结果显示miR-34a/b/c-5p可在mRNA水平抑制RAD51。双荧光素酶报告基因结果显示miR-34a/b/c-5p可分别靶向结合RAD51mRNA 3’UTR序列的137-158 nt、137-159 nt以及136-158 nt位点。(9)miR-34a/b/c-5p能够上调p53 mRNA和蛋白表达水平。在HCT116 p53~(wt)细胞中,miR-34a/b/c-5p对RAD51的抑制作用要明显强于在HCT116 p53~(-/-)细胞中miR-34a/b/c-5p对RAD51的抑制作用,而且在HCT116 p53~(wt)细胞中γH2AX蛋白水平要明显高于HCT116 p53~(-/-)细胞中γH2AX蛋白表达水平。讨论:(1)miR-34家族均可不同程度地诱导DSBs发生,且具有细胞特异性,在HCT116细胞中miR-34b-3p的作用较弱。(2)miR-34s家族可诱导细胞发生不同程度的G1期阻滞,增殖抑制以及凋亡,这些结果与DSBs表型基本符合,表明miR-34s通过诱发DSBs进而引起G1期阻滞、抑制增殖和促进凋亡。(3)我们发现miR-34a/b/c-5p可在mRNA水平和蛋白水平抑制RAD51的表达。DR-GFP/I-SceI HR修复报告系统结果显示miR-34a/b/c-5p和si-RAD51均能够明显抑制HR修复效率,过表达RAD51可部分逆转miR-34a/b/c-5p引起的DSBs表型。这些结果充分证实了miR-34a/b/c-5p是通过抑制RAD51引起HR修复活性减弱进而引起DSBs发生。(4)miR-34a/b/c-5p对RAD51的抑制作用不仅存在直接抑制,也存在间接调控。我们利用HCT116 p53~(wt)和HCT116 p53~(-/-)细胞发现p53参与了miR-34a/b/c-5p对RAD51的抑制作用。
【图文】：

诱导细胞,家族,军事科学院,成员

军事科学院硕士学位论文程中需要施加凋亡诱导剂，以便于调整补偿。1.2 结果miR-34s 不同程度上调 γH2AX 蛋白表达水平在 DSBs 形成后，染色质中组蛋白 H2AX 的 SQE 结构域中 Ser139 残基迅酸化形成 γH2AX。γH2AX 作为 DNA 损伤标志物已经被广泛证实，本研在多种细胞中（HCT116、HT29、U2OS 细胞）分别转染 miR-34s 和阴性miR-NC 模拟物，于转染后 48 h 收集细胞进行 western blot 检测 γH2AX 蛋水平，，进而分析 miR-34s 能否诱导细胞内 DNA 损伤产生。研究结果显示：4s 家族每个成员均可不同程度上调细胞内 γH2AX 蛋白表达水平，而且在胞类型中，该作用结果不完全一致，表明 miR-34s 家族每一个成员均可不诱导细胞内 DNA 损伤，但其作用具有细胞特异性（图 1-1）。

焦点,转染,诱导细胞,家族

军事科学院硕士学位论文可接触性，导致特异性 DNA 损伤修复蛋白被招募和聚集至 DNA 断裂位点并形成焦点[11,12]。基于免疫荧光法能够清晰地看到细胞核内散在的 γH2AX 焦点，此方法已经成为一种非常灵敏可靠的检测 DSBs 的方法。图 1-1 结果提示过表达miR-34s 可诱导细胞内发生 DSBs，为了进一步验证，我们在 HCT116 细胞中转染 miR-34s 和阴性对照 miR-NC 模拟物，于转染后 48 h 终止细胞培养并利用间接免疫荧光法分析 miR-34s 家族对 γH2AX foci 形成的影响。实验结果显示：在转染后 48h，除了 miR-34b-3p，其它家族成员均能明显增加细胞内 γH2AX 焦点（图 1-2），该结果与图 1-1 中 miR-34s 家族对 HCT116 细胞作用结果基本一致，进一步证实了 miR-34s 可不同程度诱导细胞内 DSBs 发生。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q75

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