人参亲环素pgCyP基因在拟南芥中的克隆表达及功能分析

发布时间：2020-05-30 14:50

【摘要】：目的:研究人参亲环素pgCyP基因在抗人参疫病和高盐胁迫中发挥的作用,为人参抗病抗逆提供更多的选择。研究人参亲环素pgCyP基因在抗肿瘤方面的作用,为抗肿瘤方面提供更多选择。方法:人参RNA通过TRizol法获得,通过RT-PCR增加CyP目的基因,TA克隆、测序基因、真核表达载体构建;农杆菌冻融法转化,农杆菌介导的花卉浸泡法转化拟南芥;潮霉素筛选以及分子鉴定法获得转基因阳性植株;野生拟南芥被用作对照组进行整株分离,对叶子和蛋白质提取物进行抗病性分析;RT-PCR法分析对拟南芥疫病胁迫前后抗病相关基因分析。对植株在培养基中和土壤中进行高盐处理及相关生理指标检测。用CCK8法对三种肿瘤细胞的细胞毒性进行检测。结果:第一,人参CyP目的基因成功扩增,该基因522bp。植物表达载体pCAMBIA1303-CyP构建成功。第二,PCR检测显示目的基因已经整入到拟南芥基因组并转录完成;Western Bolt实验显示了目的基因CyP蛋白成功翻译。第三,转基因植物疫病菌胁迫前后CyP蛋白表达高于野生型(P0.05);疫病胁迫后,转基因拟南芥植物生长状态优于野生型;转基因植物的离体叶子对人参疫病菌抵抗能力具有更好的抗性;转基因植物的蛋白提取物也可以减慢疫病孢子增长。第四,RT-PCR结果显示疫病菌胁迫前的抗病基因PRs较低并且阳性植物和野生型植物的含量没有明显区别;疫病菌胁迫后PRs含量显著上升,转基因拟南芥PRs含量要比野生型更多(P0.05)。第五,抗盐实验结果表明:高盐条件下,与野生型相比,转基因拟南芥叶绿素相对含量大幅提高,水丢失率较低,电解质率降低。单位鲜重脯氨酸表达量上升。第六,CCK8法检测结果表明:转基因型拟南芥蛋白对三种肿瘤细胞有抑制作用。结论:人参CyP基因有一定的抗病抗逆抗肿瘤作用。
【图文】：

电泳图,电泳图,酶切鉴定,重组质粒

3.1 CyP基因表达载体的构建及鉴定CyP基因和pMDTM18-T克隆载体连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提质粒并酶切。结果如图1.1所示，单酶切后在3000-5000bp处出现单带，BamHI与XbaI双酶切后在3000-5000bp和500-700bp处各出现单带，分别为pMDTM18-T载体与CyP基因片段。CyP基因插入pCAMBIA1303多克隆位点，构建植物表达载体，转移至大肠杆菌中进行菌液PCR检测。结果如图1.2所示，PCR产物在500~700bp处有明显条带。5.0kb3.0kb2.0kb800bp500bp300bp1.0kb700bp500bp400bp300bp200bp100bp1 DL 5000TMDNA Maker；2 载体 pCAMBIA1303 双酶切 3 载体 pCAMBIA1303 单酶切 4 重组质粒双酶切；5 重组质粒单酶切；6 重组质粒 7DL1000TMDNAMaker；图 1.1 酶切鉴定电泳图1 2 3 4 5 6 7

电泳图,菌液,PCR鉴定,重组质粒

双酶切后在3000-5000bp和500-700bp处各出现单带，分别为pMDTM18-T载体与CyP基因片段。CyP基因插入pCAMBIA1303多克隆位点，构建植物表达载体，转移至大肠杆菌中进行菌液PCR检测。结果如图1.2所示，，PCR产物在500~700bp处有明显条带。5.0kb3.0kb2.0kb800bp500bp300bp1.0kb700bp500bp400bp300bp200bp100bp1 DL 5000TMDNA Maker；2 载体 pCAMBIA1303 双酶切 3 载体 pCAMBIA1303 单酶切 4 重组质粒双酶切；5 重组质粒单酶切；6 重组质粒 7DL1000TMDNAMaker；图 1.1 酶切鉴定电泳图1 2 3 4 5 6 7
【学位授予单位】：长春中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;S567.51

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