十字花科黑腐病菌中与全局转录后调控蛋白RsmA结合的蛋白鉴定

发布时间：2020-06-03 20:22

【摘要】：RsmA(Repressor of secondary metabolism A,次生代谢抑制蛋白),在有些细菌中也叫CsrA(Carbon storage regulator A,碳储存调控蛋白),广泛存在于各种细菌中,作为全局转录后调控因子在中心碳代谢、糖异生、糖原合成、生物被膜形成、鞭毛产生、群体感应和致病等生理过程中发挥非常重要的调控作用。我们课题组之前的研究发现,在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestrispv.campestris,Xcc)4中,RsmA作为全局转录后调控因子在致病、HR反应、胞外多糖产生、胞外酶活性、细胞运动以及生物膜形成等多个生理过程中起重要作用,但作用机制尚未完全清楚。RsmA是一个典型的RNA结合蛋白,长期以来,人们普遍认为RsmA只能通过与靶标mRNA的结合来行使其调控功能。但是,最近的研究发现,RsmA也能够通过与其它蛋白的结合来发挥作用。我们猜测,在Xcc中,RsmA可能也会通过蛋白-蛋白互作来发挥作用。基于这个推测,本研究拟通过交联和免疫共沉淀技术,在全基因组水平上鉴定Xcc细胞中与RsmA结合的蛋白。为了鉴定Xcc细胞中所有与RsmA结合(包括瞬间结合和弱结合)的蛋白,我们在丰富培养基NYGB中分别培养表达RsmA-3F蛋白(RsmA蛋白C端带有3×Flag抗原标签)的菌株,即2506-3F,以及对照菌株Xcc8004(表达不带任何抗原标签的RsmA蛋白),菌体经紫外交联(使得RsmA与其靶蛋白发生共价结合)后进行总蛋白提取,接着用3×Flag磁珠将‘RsmA-蛋白复合体'从总蛋白中共沉淀出来,最后通过质谱分析来确定沉淀出来的'RsmA-蛋白复合体'中包含的蛋白种类,从而发现与RsmA结合的蛋白。结果显示,从2506-3F菌株中获得的'RsmA-蛋白复合体'中有76种蛋白,而从对照菌株Xcc8004中获得的'RsmA-蛋白复合体'中只有16种。经过比较分析,我们确定了 48个蛋白作为与RsmA结合的候选蛋白。有意思的是,在这48个候选蛋白中,有19个蛋白是Xcc中心碳代谢途径中的酶,预示RsmA可以通过蛋白-蛋白互作来调控中心碳代谢。为了明确这48个候选蛋白是否真的与RsmA结合,我们采用细菌双杂交技术对部分候选蛋白与RsmA的互作进行了验证。结果证明了一个强互作的蛋白ProA(XC1880)以及7个弱的互作蛋白[Conserved hypothetical protein(XC0932)、PpsA(XC1952)、RpfA(XC2329)、RpoA(XC3316)、RpsG(XC3344)、RpoB(XC3347)和RplA(XC3350)]。为了进一步确认这些在细菌双杂交实验中显示为阳性的蛋白是否真的与RsmA直接结合,我们采用了交互免疫共沉淀技术进行再次验证。结果证明,ProA蛋白确实能够与RsmA直接结合。本研究证明了Xc 的RsmA能够与ProA蛋白直接结合,预示Xcc中RsmA也能通过与蛋白互作来发挥其调控作用。ProA是继FliW和CesT之后,第三个发现的与RsmA结合的蛋白。我们的研究拓宽了人们对RsmA作用机制的认识。
【图文】：

亲和力,蛋白,类型,复合物

学硬士学位论文逦十字花科黑腐病菌中与全局转录后调拉蛋白ＲｓｍＡ结合的蛋以进一步细分成弱瞬时复合物和强瞬时复合物［８４］：弱瞬时复合物在体内表现物的动态混合，而强瞬时复合物只有在被触发的情况下才改变其四聚体状态，体的结合职］。弱瞬时相互作用的解离常数（ＫＤ）在微摩尔范围，周期是秒相互作用，因为有效应物分子的稳定作用，，所以持续的时间会更长，并且有解离常数（ＫＤ）邋［８５］，在纳米摩尔范围（蛋白质互作的结合力强弱通常与解比关系）［８３１。这一类型的互作包括由效应分子或构象变化触发或稳定的蛋白。Ｒａｓ蛋白就是一个例子，当与ＧＴＰ结合时，其能与伴侣形成紧密的复合物；结合时却只能形成弱的复合物＠１。蛋白质作用力强弱及分类可用下图来总结

原理图,双杂交,细菌,原理

图１－２细菌双杂交的原理【１Ｑ７］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ逡逑双杂交系统包括了三个部分，ｐＢＴ质粒、ｐＴＲＧ质粒和ＸＬｌ－ＢｌｕｅＭＲＦ＇Ｋａｎ邋ｓｔ的片段导入ｐＢＴ质粒中，把靶标基因片段导入ｐＴＲＧ质粒中，质粒构建成功中。当￥Ｅ标质粒和诱馆质粒能够互作，那么就会连接起来，使得Ｘｃｌ（Ｘ邋ｏｐｅｒａｔｏ上的／／７Ｓ３邋（编码的产物是３－ＡＴ的拮抗物）和ａａ以（链霉素抗性）基因。／／Ｚ后表现为报告菌株能够在含有３－ＡＴ和链霉素抗性的双重筛选平板上正常生长花科黑腐病菌的致病机理研究进展逡逑
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q933

【参考文献】