SIRT1在皮质酮诱导的细胞应激模型中调控自噬的机制研究

发布时间：2020-06-04 03:02

【摘要】：现代生活中人们遭遇到各种应激性事件时,机体内的下丘脑-垂体-肾上腺轴会被激活,促使肾上腺释放一种重要的糖皮质激素——皮质醇(啮齿动物中主要是皮质酮)。慢性应激会诱导糖皮质激素的持续释放并且引起许多严重的健康问题,例如情绪障碍,心血管疾病和自身免疫疾病等。许多研究表明皮质酮的神经毒性作用是通过增加氧化应激和细胞凋亡介导的。尽管已有研究证实SIRT1能够通过启动自噬从而对氧化应激和DNA损伤起到保护作用,但它和自噬在皮质酮诱导的应激中的作用还需进一步研究。本研究首先利用不同浓度的皮质酮对脊髓前角运动神经元瘤细胞进行不同时间的处理,通过CCK-8检测细胞活力以确定最佳的处理条件,从而建立细胞应激模型。然后,通过转染过表达和敲减质粒调控细胞内SIRT1的表达水平,同时利用免疫印迹,荧光定量PCR等方法检测皮质酮处理后细胞内自噬相关蛋白的表达情况,从而检测SIRT1在细胞应激条件下是如何调控自噬的。我们还利用TUNEL染色,检测SIRT1过表达细胞在皮质酮处理后的细胞凋亡水平,从而明确SIRT1在应激条件下对细胞凋亡的影响作用。我们的研究发现随着皮质酮浓度的增加,细胞活力逐渐下降,SIRT1和LC3BⅡ/Ⅰ的水平分别呈现剂量依赖性降低和增加。而SIRT1过表达可以抑制皮质酮诱导的自噬并且促进细胞凋亡。抑制SIRT1的表达则可以促进皮质酮诱导的自噬水平。这些发现能够帮助我们更好的了解SIRT1和自噬在慢性应激中发挥的作用。
【图文】：

３．３过表达ＳＩＲＴ１能够抑制皮质酮引起的自噬逡逑为了确定皮质酮处理引起的ＳＩＲＴ１下调和自噬启动之间的关系，我们首先构逡逑建了邋ＳＩＲＴ１过表达和敲减体系。如ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ结果显示（图３Ａ，邋３Ｂ），在转染了逡逑过表达质粒后，ＳＩＲＴ１的表达水平增加了两倍以上（图３Ｃ）。我们又构建了两种不逡逑同的ＳＩＲＴ１特异性ｓ＿Ａ，其中一种能够显著降低ＳＩＲＴ１的表达丰度，并被选择逡逑用于随后的实验（图３Ｄ）。逡逑细胞转染相应质粒２４ｈ后，在含２００逦皮质酮的培养基中继续培养２４ｈ，随逡逑后提取蛋白并用于免疫印迹实验（图４Ａ，５Ａ）。和我们之前的实验结果一致，皮逡逑质酮处理可以显著降低ＳＩＲＴ１的表达并且增加ＬＣ３ＢＭ的水平（图４Ｂ，，４Ｃ）。而逡逑过表达ＳＩＲＴ１可以将自噬恢复到正常的水平（图４Ｃ）。皮质酮处理和ＳＩＲＴ１过表逡逑达都没有影响Ａｔｇ５的表达（图４Ｄ）。虽然皮质酮的加入显著增加了邋ｐ６２的表徸，逡逑但ＳＩＲＴ１过表达质粒的转染却没有进一步改变该蛋白的水平，表明ＳＩＲＴ１可能对逡逑自噬体的降解没有影响。逡逑２０逡逑

用于随后的实验（图３Ｄ）。逡逑细胞转染相应质粒２４ｈ后，在含２００逦皮质酮的培养基中继续培养２４ｈ，随逡逑后提取蛋白并用于免疫印迹实验（图４Ａ，５Ａ）。和我们之前的实验结果一致，皮逡逑质酮处理可以显著降低ＳＩＲＴ１的表达并且增加ＬＣ３ＢＭ的水平（图４Ｂ，４Ｃ）。而逡逑过表达ＳＩＲＴ１可以将自噬恢复到正常的水平（图４Ｃ）。皮质酮处理和ＳＩＲＴ１过表逡逑达都没有影响Ａｔｇ５的表达（图４Ｄ）。虽然皮质酮的加入显著增加了邋ｐ６２的表徸，逡逑但ＳＩＲＴ１过表达质粒的转染却没有进一步改变该蛋白的水平，表明ＳＩＲＴ１可能对逡逑自噬体的降解没有影响。逡逑２０逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R338

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本文编号：2695793