大豆U6启动子活性分析及其在基因编辑中的应用

发布时间：2020-06-05 16:07

【摘要】：大豆是世界第四大作物,是重要的经济作物,在农业中占有重要地位。大豆是农作物中蛋白质含量最高的作物,蛋白质含量高达35%-40%;大豆作为优质的食用油,出油率在18%-20%,是人类蛋白质和食用油的重要来源。除此之外,大豆还可以作为饲料,工业产品的原材料;大豆种子还可以加工成多种食物产品,如冲调饮用蛋白制品和添加剂用蛋白制品等。大豆产量需求的持续增加,迫使需要优质、高产、抗逆性强的大豆品种。利用CRISPR-Cas9可以快速高效的实现大豆品种的改良。在CRISPR-Cas9系统中,U6启动子常被用于驱动sgRNA的转录,是CRISPR-Cas9系统中重要的元件。适用于大豆且能够高效转录的大豆U6启动子尚未报道,而亲缘关系较远的物种间的U6启动子不一定适用。因此本研究的目的:筛选具有较高转录活性和编辑效率的大豆U6启动子。方法:本研究克隆了大豆11个U6启动子,通过驱动GUS基因的表达对大豆U6启动子在大豆发状根和拟南芥中的转录活性进行了分析。同时选取4个大豆基因作为基因编辑的目的基因,诱导大豆形成发状根,通过DNA聚合酶链式反应和限制性内切酶酶切(RE-PCR)检测大豆目的基因的突变效率,筛选出具有最高效编辑效率的大豆U6启动子,可以用于敲除或沉默大豆相关功能基因,从而获得营养丰富或优质的大豆,为CRISPR-Cas9系统在大豆分子育种中的应用提供基础。主要研究结果如下:1.在大豆全基因组水平上克隆了11个GmU6启动子,片段大小分别为352bp,256 bp,342 bp,236 bp,342 bp,257 bp,279 bp,314 bp,280 bp,306 bp,294 bp。基于11个GmU6启动子构建了p3301-GUS-GmU6-1~p3301-GUS-GmU6-11真核表达载体,并用于植物转化。2.本研究通过农杆菌K599介导的转化大豆发状根和农杆菌GV3101转化拟南芥,系统地分析和比较了11个GmU6启动子的转录活性。结果我们发现,在大豆发状根中GmU6-1,GmU6-4,GmU6-7,GmU6-8,GmU6-10和GmU6-11启动子的转录水平都明显高于GmU6-5启动子;而在拟南芥中GmU6-2,GmU6-3,GmU6-4,GmU6-7,GmU6-8,GmU6-10和GmU6-11转录活性都高于GmU6-5启动子。综合11个U6启动子在豆子发状根和拟南芥叶片中的相对表达水平来看,GmU6-4,GmU6-7,GmU6-8,GmU6-10和GmU6-11启动子转录活性相对较高。3.本研究中,我们选取了大豆四个基因作为基因编辑的靶基因,并且为每个基因分别设计了对应的sgRNA。最终构建了Glyma06g14180-pCas9-GmU6-1~Glyma06g14180-pCas9-GmU6-11,Glyma03g36470-pCas9-GmU6-1~Glyma03g36470-pCas9-GmU6-11,Glyma11g253000-pCas9-GmU6-1~Glyma11g253000-pCas9-GmU6-11,Glyma14g04180-pCas9-GmU6-1~Glyma14g04180-pCas9-GmU6-11,共44个载体,并用作大豆发状根的转化。4.通过PCR-RE方法检测44个载体转化的大豆发状根的突变情况,结果发现11个GmU6启动子在不同的基因中发生的突变类型是不一样的,Glyma03g36470、Glyma14g04180和Glyma11g253000涉及的突变类型主要是碱基的缺失,而Glyma06g14180的突变类型大多数是碱基插入和缺失。GmU6-8和GmU6-10启动子在Glyma06g14180,Glyma03g36470,Glyma14g04180三个基因中的编辑效率分别为22.1%,26.6%,12.1%;20.5%,14.7%,15.9%。结合11个GmU6启动子在大豆发状根和拟南芥中的转录活性,我们发现GmU6-8和GmU6-10启动子在CRISPR-Cas9系统中的基因编辑效率相对较高(平均突变率分别为20.3%和20.6%)。
【图文】：

图 1-2 CRISPR-Cas9 原理[49]Fig. 1-2 The theory of CRISPR-Cas9 CRISPR-Cas9 基因编辑技术在植物基因功能中的研究进.基因敲除前，CRISPR-Cas9 系统最主要应用于包括植物在内的多种生物的且可以同时针对多个靶基因。例如，朱健康[50]研究小组使用 CRISP重基因编辑，创建一个 PYL/PYR 六元组突变体，使用一个包含六 表达盒的结构，它为快速创建多个基因敲除提供了强大的工具，余问题。在小麦中，Zhang[51]等靶向 GASR7 基因增加小麦的千粒[52]在黄瓜中靶向 eIF4E 基因，提高了黄瓜的病毒抗性。还有研究[53 CRISPR-Cas9 系统定点敲除 ZmTMS5 基因，所有 T0 代植株都进的修饰，并且 tms5 突变体稳定传递到下一代，产生温敏雄性不育.目标基因替换/插入

11图 1-3 技术路线Fig. 1-3 Technical route1.8 研究目的及意义大豆富含蛋白质和油脂，是我们人类植物型蛋白和食用油的重要来源，在我国国民膳食体系中发挥着重要的功能。大豆种子能加工成多种食物，如豆浆，豆腐，豆奶等；同时它还含有众多有益于人体健康的活性成分，如异黄酮，维生素E，皂甙，磷脂等，是重要的油料作物。大豆在食品中应用的广泛性以及大豆产量增加的需求，促使我们培育优良高产以及抵抗外界环境胁迫能力的大豆。利用CRISPR-Cas9 可以改良大豆，在 CRISPR-Cas9 系统中，U6 RNA 对应的 U6 启动子常被用于驱动 sgRNA 的转录，是 CRISPR-Cas9 系统中重要的元件[104]，但亲缘关系较远的物种间的 U6 启动子并不一定适用，且适用于大豆并高效转录的自
【学位授予单位】：河北工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S565.1;Q943.2

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 王永生;刘微;张晓翔;赵静红;;大豆新品种德豆10的选育与栽培技术要点[J];农业科技通讯;2019年12期

2 李强;王雪娇;李婷;赵晓宇;张万海;苏二虎;;早熟、高产大豆新品种登科13选育及栽培技术[J];大豆科技;2019年05期

3 刘艳;王秋玲;;高油夏大豆新品种菏豆32号的选育及栽培要点[J];大豆科技;2019年05期

4 杨芳;张小贝;邓军波;陈艳;黄昌武;;江汉平原夏播大豆新品种(系)引进栽培初步评价[J];大豆科技;2018年06期

5 ;《大豆科技》2018年总目次[J];大豆科技;2018年06期

6 ;大豆新品种“石885”通过国家审定[J];种业导刊;2018年12期

7 ;黑龙江:大豆变“金豆” 品种来“破冰”[J];吉林农业;2019年02期

8 ;大豆新品种“石885”通过国家审定[J];科学种养;2019年02期

9 石慧;王思明;;从引种到繁盛:大豆在美国的历史追溯[J];自然辩证法研究;2019年03期

10 ;高产高油型大豆新品种“石885”通过国审[J];农村百事通;2019年06期

相关会议论文 前10条

1 张文杰;李文国;李万超;刘孔英;赵丽华;于龙;;大豆新品种北国919[A];第23届全国大豆科研生产研讨会论文摘要集[C];2012年

2 朱星陶;陈佳琴;杨春杰;黄建斌;谭春燕;;高产大豆新品种黔豆7号的选育[A];第23届全国大豆科研生产研讨会论文摘要集[C];2012年

3 马俊奎;任海红;任小俊;王勇;赵晶云;刘学义;;高度抗旱大豆新品种汾豆62选育[A];第23届全国大豆科研生产研讨会论文摘要集[C];2012年

4 张丽莉;杨凌舒;杨宏宝;徐鹏;杨柏鹤;高荣;苏文武;姜洪;;首豆34号大豆新品种丰产栽培技术研究报告[A];第24届全国大豆科研生产研讨会论文摘要集[C];2014年

5 纪永民;张存岭;;国审高产稳产大豆新品种濉科998[A];第23届全国大豆科研生产研讨会论文摘要集[C];2012年

6 宋书宏;王文斌;曹永强;;高油、高产、广适大豆新品种辽豆32[A];第24届全国大豆科研生产研讨会论文摘要集[C];2014年

7 宋淑云;晋齐鸣;张伟;李红;沙洪林;王立新;;吉林省大豆新品种(系)抗大豆花叶病毒病总体评价与抗性分析[A];中国植物病理学会2006年学术年会论文集[C];2006年

8 陈新;顾和平;高兵;张智民;;高产优质鲜食春大豆新品种江蔬1号的选育[A];江苏省遗传学会植物分子育种学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年

9 陈佳琴;朱星陶;杨春杰;谭春燕;李振动;;抗病大豆新品种黔豆11号的选育[A];第十届全国大豆学术讨论会论文摘要集[C];2017年

10 姜成喜;陈维元;付亚书;景玉良;付春旭;王金星;姜世波;单大鹏;张维耀;吕德昌;;高产抗病大豆新品种绥农33选育报告[A];第23届全国大豆科研生产研讨会论文摘要集[C];2012年

相关重要报纸文章 前10条

1 石明山;大豆新品种“东生5号”通过审定[N];科学时报;2011年

2 李木子;大豆新品种“科豆1号”审定通过[N];科学时报;2011年

3 本报记者 王玮;大豆变“金豆” 品种来“破冰”[N];黑龙江日报;2019年

4 王玮;黑龙江：大豆变“金豆” 品种来“破冰”[N];粮油市场报;2019年

5 对话记者 陈琼;在科技深海 他探秘“大豆”[N];长春日报;2019年

6 本报记者 祖yNyN;大豆振兴 良种先行[N];农民日报;2019年

7 祖yNyN;大豆振兴良种先行[N];粮油市场报;2019年

8 本报记者 孙昊;9年培育大豆新品种20个[N];黑龙江日报;2019年

9 张梅;陕西首个耐热大豆品种通过审定 可有效缓解减产[N];粮油市场报;2019年

10 农业科技报社全媒体记者 耿苏强;耐热大豆品种“秦豆2018”通过审定[N];农业科技报;2019年

相关博士学位论文 前10条

1 钟超;大豆抗疫病基因发掘及特异性标记开发[D];中国农业科学院;2018年

2 刘薇;大豆开花调控基因GmFT1a的克隆和功能研究[D];中国农业科学院;2018年

3 宋健;大豆种皮色相关基因的图位克隆及功能解析[D];中国农业科学院;2019年

4 吕祝章;大豆遗传图谱构建、重要农艺性状QTL定位及优异基因发掘[D];山东农业大学;2006年

5 梁慧珍;大豆子粒性状的遗传及QTL分析[D];西北农林科技大学;2006年

6 袁凤杰;大豆低植酸突变种质的创新及其生化特性和分子遗传学研究[D];浙江大学;2007年

7 李宏宇;大豆转化体系的构建及转化植株的功能分析[D];中国农业科学院;2006年

8 秦君;大豆品种绥农14遗传基础分析及优异基因鉴定[D];河北农业大学;2008年

9 杨勇;大豆亲本及其体细胞杂交后代的耐盐性和光合特性比较[D];浙江大学;2007年

10 刘焕成;大豆维生素E遗传变异、QTL及环境互作效应分析[D];东北农业大学;2017年

相关硕士学位论文 前10条

1 胡跃;大豆茎秆相关性状QTL定位[D];四川农业大学;2018年

2 邸一桓;大豆U6启动子活性分析及其在基因编辑中的应用[D];河北工程大学;2019年

3 田美;吉林35大豆胚尖遗传转化体系的优化及GmMYB12B2基因的遗传转化[D];吉林大学;2019年

4 杨琳;吉大豆5号子叶节遗传转化体系的优化及GmPEPC4基因的功能分析[D];吉林大学;2019年

5 武新艳;山西各生态区大豆农艺性状与产量相关性分析[D];山西农业大学;2017年

6 吴浩;大豆结瘤发育过程中DNA甲基化的动态分析[D];华中农业大学;2018年

7 孙雪慧;耐盐基因ScHAL1和ZmHKT转入大豆的研究[D];长春师范大学;2018年

8 明坤;大豆品种间脂氧酶活性差异及其与农艺性状的相关分析[D];东北农业大学;2018年

9 程春光;大豆结荚高度标记的开发及利用[D];东北农业大学;2018年

10 裴友财;大豆EMS诱变群体M2代主要品质性状遗传分析及脂肪酸脱氢酶FAD2相关SNP标记的开发[D];吉林农业大学;2018年

，

本文编号：2698289