裂解性多糖单加氧酶产生活性氧驱动木质素生物降解

发布时间：2020-06-05 20:02

【摘要】：裂解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO)是一类广泛存在于真菌、细菌中的单铜氧化酶。当外源电子供体及氧存在时,LPMO活性中心可形成Cu-氧中间体,氧化断裂纤维素或半纤维素。但是木质素抗性屏障通常会限制酶与纤维素或半纤维素的结合,当LPMO结合受阻时,Cu-氧中间体则释放出活性氧并产生与木质素生物降解密切相关的H_2O_2。如果LPMO能够通过产生H_2O_2或者其他途径参与并促进木质素生物降解,将在木质素的生物降解以及解除碳素循环的限制因素方面意义重大,然而目前对LPMO是否参与木质素降解及其机制知之甚少。因此本论文针对LPMO是否参与木质素的生物降解及其机制如何这一科学问题,基于功能基因组学研究了LPMO与木质素降解修饰过氧化物酶(lignin-degrading and-modifying peroxidase,LDMPE)之间的可能关联。在此基础上,通过体内外实验揭示了以木质素降解真菌—白腐菌为主的LPMO参与降解木质素的途径和机制。论文主要研究结论如下:(1)真菌、细菌LPMO和LDMPE之间共发生具有普遍性对71株木质纤维素降解菌进行功能基因组比较分析结果显示:88.7%的基因组中都存在LPMO。基因组中的LPMO与木质素降解修饰酶(lignin-degrading and-modifying enzyme,LDME)之间普遍存在共发生现象,且主要发生在LPMO和LDMPE之间。98.2%的真菌基因组中LPMO和LDME共发生,其中白腐菌基因组中的LPMO和LDPME之间的共发生性具有普遍性占83.9%。细菌基因组中LPMO和LDME之间的共发生性为46.7%,主要存在于细菌,尤其放线菌门为主的LPMO与关键LDMPE—染料脱色过氧化物酶(dye-decolorizing peroxidase,DyP)之间。真菌和细菌基因组中的LPMO与LDMPE在数量上均具有较强相关性(r0.6),其中在具有较强木质素降解能力的白腐菌(真菌)和放线菌门(细菌)中相关性最高。表明LPMO与LDMPE在基因组层面上存在关联,尤其是在木质素降解能力最强的白腐菌中相关性最高,达到0.807,可能与木质素降解相关。(2)揭示了白腐菌LPMO介导木质素降解的不同途径及机制异源表达获得了来源于白腐真菌Pleurotus ostreatus BP3的且具有生物活性的PoLPMO9A,并且从其电子供体等方面明确了其反应特征。基于此进一步从体外驱动的LDMPE反应和增强醌-氢醌氧化还原循环所诱导的芬顿反应途径等2个方面研究了LPMO介导的木质素降解新机制。结果表明,当存在Ⅱ型过氧化物酶PsVP(真菌LDMPE)及相应的还原剂时,还原型LPMO产生的H_2O_2优先被PsVP利用,驱动PsVP实现单体、二聚体木质素模型化合物和木质素高分子的降解。碱木素和天然木质素高分子被LPMO-PsVP体系降解后木质素衍生物总相对丰度分别下降了17.1%和6.3%。另一方面,LPMO与漆酶等木质素酶类似,可以氢醌为电子供体将其氧化为半醌自由基,同时产生H_2O_2并促进Fe~(3+)还原参与并增强醌氧化还原循环诱导的芬顿反应,显著促进羟自由基(HO·)产生。LPMO介导的芬顿反应机制是半醌驱动的芬顿反应机制。H_2O_2的产生和Fe~(3+)的还原与氢醌种类、氢醌的含量及LPMO的含量有关。在500?M 2,6-二甲氧基-1,4-对苯二酚(DBQH_2)条件下,HO·含量较无LPMO的氢醌氧化还原体系提高了2.77倍。由此揭示LPMO可作为辅助酶,通过驱动LDMPE反应和增强醌氧化还原循环诱导的芬顿反应等2条途径,参与木质素的降解。(3)利用链霉菌验证了LPMO体内外介导木质素降解功能以Streptomyces coelicolor M145(ScM145)为对象,从体外和体内两个方面证实了LPMO参与了生物体对木质素的降解。克隆和同源表达了2条在木质素基质存在条件下相对转录水平上调最显著(3~11倍)的LPMO基因Sclpmo10B和Sclpmo10D,通过接合转移获得了同源过表达LPMO的重组链霉菌Sc M145-ΔLPMO10B(+)和ScM145-ΔLPMO10D(+)。体外实验表明链霉菌来源的LPMO也能够通过驱动LDMPE反应和芬顿反应途径参与木质素降解。体内功能验证表明,较野生型链霉菌ScM145相比,过表达LPMO链霉菌ScM145-ΔLPMO10B(+)和ScM145-ΔLPMO10D(+)对木质素的降解能力显著增强,降解木质素9天后,木质素衍生物总丰度分别下降25.4%和31.0%,较野生型ScM145分别增强了2.65和3.23倍,同时过表达菌株的铁还原能力和木质素解聚释放的总酚含量也显著提高。由此证实了来自于白腐菌等的LPMO在木质素降解中可能发挥作用,且分属于不同门中的实验菌株LPMO具有同样的机制参与木质素降解途径。综上所述,本研究首次发现并揭示了LPMO以不同的反应途径及机制介导白腐菌等的木质素生物降解。相关研究结果不仅拓展LPMO的生物学功能,明晰了LPMO在木质纤维素腐朽中的新作用,也为进一步明晰木质纤维素生物降解的机制奠定了理论基础。
【图文】：

真菌,细菌,电子,多糖

华中科技大学博士学位论文4（A）（B）图1.1真菌和细菌LPMO活性位点[28]Figure1.1Coppercontainingactivesiteofbacterial(A)andfungal(B)LPMO.尽管不同LPMO在活性位点的构象上存在显著差异，但他们大都具有相似的3D结构和催化特征：（1）具有一个较平坦的活性中心，可以与纤维素的结晶部分相互作用；（2）金属依赖性，特别是对铜具有催化活性；铜离子容纳在称为组氨酸支架的结构中，保守的组氨酸存在于C-和N-末端；（3）依赖外部电子供体来还原铜离子[29;32;33]。活性中心二价铜离子具有广泛的夺取还原剂电子并传递电子的能力。1.1.2.2裂解性多糖单加氧酶催化机制裂解性多糖单加氧酶的多糖催化机制[34;35]，如图1.2所示。由电子供体提供一个电子将LPMOCu（Ⅱ）还原成Cu（Ⅰ）是反应的起始步骤。随后还原型的LPMO活性位点Cu（Ⅰ）与O2反应形成Cu（Ⅰ）-O中间体，经过脱水后形成Cu（Ⅱ）-O-O复合物进攻多糖底物，，经过转移第二个电子和2个质子，使糖苷键断裂，并将多糖底物氧化，产生寡糖和氧化型的寡糖。O2驱动的LPMO催化机制完成整个催化循环过程一共需要2个电子和2个质子，形成产物的量与还原剂的量具有化学计量相关性。整个裂解性多糖单加氧酶催化反应的关键在于存在有效的电子供体作为还原剂将LPMO活性中心的Cu（Ⅱ）还原成Cu（Ⅰ），目前已报道多种不同类型的还原剂均能够作为LPMO的电子供体。

多糖,机制,供体,电子

华中科技大学博士学位论文5图1.2裂解性多糖单加氧酶催化机制[34]Figure1.2LPMOreactionpathways.1.1.3裂解性多糖单加氧酶电子供体及与氧化还原酶之间的相互作用还原剂/电子供体（类型和浓度）是LPMO催化功能的主要决定因素。LPMO催化反应可以通过各种电子供体来启动[36]，来源广泛，包括非酶来源的小分子还原剂，如抗坏血酸和几种酚类，木质素和木质素片段和光驱动系统以及能够提供还原当量的酶，如纤维二糖脱氢酶。此外，一些真菌氧化还原酶与LPMO之间存在相互作用，氧化还原酶降解产物能够作为LPMO电子供体将其还原，如图1.3所示。1.1.3.1非酶来源电子供体（1）小分子电子供体抗坏血酸是公认的最常见的LPMO电子供体[10]。一些其他的小分子化合物或酚类，例如2,6-二甲氧基-1,4-对苯二酚（DBQH2）、半胱氨酸、没食子酸等也可以作为有效电子供体还原LPMO[37]。Frommhagen等[38]共研究了34种电子供体，发现植物来源的类黄酮和木质素来源的衍生物1,2-苯二醇或1,2,3-苯三醇能促进的LPMO活性，而单酚和含硫化合物存在下对纤维素氧化存在低活性。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55

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