集成化糖蛋白质组学方法的发展

发布时间：2020-06-08 12:02

【摘要】：蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,糖链与蛋白质氨基酸连接的位点称为糖基化位点。糖蛋白质组学的分析一般包括糖基化位点的检测,糖链结构的解析和完整糖肽鉴定。糖蛋白组学分析的样品处理步骤一般包括蛋白质的酶解、糖蛋白或糖肽的富集、去糖基化和脱盐等。然而目前的大多数方法只能单一地分析糖基化位点和糖链,不仅操作耗时并受到毫克级蛋白质起始量的限制。本论文基于枪头设计了一种简单、集成化的糖蛋白质组学技术(simple and integrated spintip-based glycoproteomics technology,Glyco-SISPROT)。该技术可以实现对毫克级别微量蛋白质样品的处理,并在较短的处理时间内实现糖蛋白质组的全面分析。通过将强阳离子交换填料SCX,C_(18)填料和伴刀豆球蛋白凝集素填料ConA整合到枪头内,并优化用量和填充方式形成了Glyco-SISPROT技术。该技术能高效地处理组织样品来源的蛋白质和多肽样品,并实现完整糖肽、糖链和去糖肽的同时大规模蛋白质组学分析。通过使用多种糖苷酶组合,约1770个去糖肽和1850个糖基化位点可以被成功地从100微克的小鼠肝脏蛋白质或100微克的小鼠肝脏多肽中检测到。其中,PNGase F糖苷酶和Endos糖苷酶都能检测到的糖基化位点约占30%。此外,以蛋白质为起始原料,Glyco-SISPROT技术能将几天的处理时间缩短到6个小时左右,并具有良好的操作重现性(单针小鼠肝样品Pearson相关系数0.92)。总之,Glyco-SISPROT技术是使用有限的蛋白质作为起始原料得到最全面的糖蛋白质组信息的方法之一。该技术适用于稀有生物样品的高灵敏度,全方面的糖蛋白质组学分析。
【图文】：

糖苷酶,特异性

图 1-1 不同糖苷酶的特异性a) PNGase F 糖苷酶的特异性 b) Endo 糖苷酶的特异性2.2 集成化糖蛋白质组学的发展传统的糖蛋白质分析策略的分析，包括蛋白质的提取，蛋白质的酶解，的富集，去糖肽和脱盐等步骤都是在溶液内进行。为了实现大规模的糖基点鉴定，蛋白质的肽键和糖苷键的酶解都需要较长的反应时间。2009 年，Zhou H 等人发展了一种以 ConA 树脂为富集材料的糖蛋白质组应器[38]。糖蛋白质在富集后转移到糖蛋白质组反应器中，该反应器结合了质的纯化、二硫键还原、去糖基化、胰蛋白酶酶解和分馏操作。在 5 μL 的血浆中鉴定到 41 种糖蛋白和 82 种糖肽，并将样品处理时间缩短至 2 小时著减少了试剂的消耗。该糖蛋白反应器提供了更大的蛋白质覆盖度和更高定准确性。但是这里的起始蛋白是已经富集分离过的糖蛋白，并没有实现步骤在内的集成化，反应器外的富集过程中会造成部分的样品损失。2011 年angY 等人发展了一种集成化的样品前处理系统，由亲水色谱柱(Hydroph

富集方法,糖蛋白

哈尔滨工业大学理学硕士学位论文的合成速率比降解速率高，，这与细胞生长的事实一致。.2 糖基化蛋白质组学的富集和酶解在生物样品中，具有诊断和治疗意义的蛋白质比其他蛋白质的含量低。由一种蛋白质的糖基化位点发生糖基化是不确定的，糖基化位点连接的糖链是也是不确定的，形成的糖蛋白具有不均一性和多样性等特点。选择有效的富集方法来降低样品的复杂度是基于质谱技术糖蛋白质组学分析的第一富集方法的选择对后续实验的研究起关键作用。如图 1-2 所示，常见的糖富集方法主要有凝集素富集法，酰肼化学法，亲水作用色谱法和硼酸亲和法。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q51

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