米黑根毛霉脂肪酶在蛋白酶缺陷型PichiaPink系统中的表达

发布时间：2020-06-08 09:25

【摘要】：米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)由于其高度的1,3位置催化专一性,使其在造纸、食品、皮革生产、生物柴油等多个行业应用广泛。巴斯德毕赤酵母表达系统兼具了原核生物表达系统表达周期短、表达量较高、易于工业化高密度培养的优点以及真核表达系统对外源蛋白进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰的特点,被认为是一种表达大规模蛋白的强有力工具。但在表达RML时,未经优化的毕赤酵母存在两个缺陷:(1)RML的分泌表达及表面展示都存在被酵母液泡蛋白酶降解的问题,同时毕赤酵母高密度发酵加剧了这一现象;(2)分泌或表面展示的RML酶活均不高,未能达到工业化生产需求。基于此,本文以商业化的蛋白酶缺陷型毕赤酵母作为宿主细胞,有效改善RML被降解的问题,并通过基因工程的手段从信号肽、锚定蛋白等方法进一步提高其分泌量和展示量,为其理论研究奠定夯实的基础。具体研究内容及结果如下:(1)本文利用SignalP4.1在线预测软件,预测出9种D值超过0.7的毕赤酵母内源信号肽:FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、FRE2、FLO9,同时筛选8种常用的毕赤酵母外源信号肽,以广泛应用的α-交配因子(α-mating factor,α-MF)信号肽为对照,考察这些信号肽对增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)和RML在PichiaPink表达系统的分泌效果。结果发现:内源信号肽FLO10、PRY2、DSE4、MSB2、SSP120、FRE2能有效介导EGFP分泌,且PRY2介导EGFP的分泌水平最高,是α-MF的2.15倍;内源信号肽FLO10、PRY2、DSE4、FRE2能有效介导RML的分泌,且FLO10介导RML的分泌水平最高,是α-MF的1.50倍;外源信号肽对EGFP和RML的分泌效果均没有α-MF好。(2)以毕赤酵母GPI型细胞壁蛋白GCW21为锚定蛋白,实现了脂肪酶RML在蛋白酶缺陷型PichiaPink表达系统中的表面展示,筛选到一株含pPink-HC高拷贝质粒的蛋白酶A缺陷型菌株GS115-ade2△-pep4△/pPink-HC-RML-GCW21,摇瓶发酵水平脂肪酶活力最高,达到121.72 U/g,比未敲除蛋白酶菌株GS115-ade2/pPink-HC-RML-GCW21提高约51.35%,比实验室构建的GS115/PHKA-RML-GCW21提高约46.7%。表面展示RML的最适的反应底物是C_8、最适温度为45℃、最适pH为8.0;同时发现Li~+、Na~+、k~+、Mg~(2+)等金属离子对RML酶活力有一定的激活作用。
【图文】：

脂肪酶,系统发育分析,工程数据库,真菌

图 1-1 从脂肪酶工程数据库中提取的酵母和其它真菌脂肪酶的系统发育分析[11]Fig.1-1 Phylogenetic analysis of yeast and other fungal lipases extracted from the lipasengineering database的折叠方式虽然为大部分脂肪酶的催化活性位点提供了稳固的骨架结构，但是其排式、数目及角度会不同程度的影响脂肪酶二级结构[18]。在脂肪酶活性中心有一个可构象改变而引起界面激活效应的“α-螺旋盖子”结构的保护[19-20]，，这个盖子结构在的体系中表现出不同的反应，当脂肪酶处于非油水界面时，其活性中心被此盖子结掩盖，脂肪酶就处于一种无活性或者低活性的状态；当酶接触油/水界面的时候，盖会打开并将其活性中心暴露，这种重排开启了对活性位点丝氨酸的接近并暴露了许水残基，使催化中心与底物结合进行反应[21-22]。4 脂肪酶的工业应用脂肪酶活性中心结构的差异性使得它们具有广泛的底物专一性包括脂肪酸特异性的位置选择性、异构体选择性，其次微生物脂肪酶还具有反应不需要辅酶、反应条

序列,黑根,脂肪酶,毛霉

肪酶肪酶简介 RML（Gene Bank 中编号 A02536）是单链α/也是第一个获得 3D 结构解析的酶，由于其在菌脂肪酶之一。RML 蛋白的结构如图 1-2，米，pI 为 3.8[31]。其蛋白质的一级结构包括 1~24肽；25~94（V~M）是 70 个氨基酸的前导肽，催化三联体 Ser144、His257 和 Asp203，此催间位置上非常相近。丝氨酸 Ser 附近的序列，属于丝氨酸水解酶类的共有特性。RML 的催 92 位）覆盖称为“盖子结构”，在疏水作用酶活性中心进行水解反应[32]，3D 脂肪酶的开
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

【参考文献】