拟南芥液泡磷酸转运体VPT家族基因的功能研究

发布时间：2020-06-09 12:12

【摘要】：磷是植物营养生长和生殖发育所必须的大量元素,它几乎参与了植物细胞的所有生理代谢过程。缺磷会使植物的生物产量严重减少。游离态无机磷(Pi)是植物可利用磷的有效形式,但在土壤中Pi的含量却非常低(约为10μM),所以在农业生产中通常施加磷肥来保证作物的产量。然而世界上用来制作磷肥的磷矿石却是一种分布不均的不可再生资源,因此如何提高植物对磷的利用效率是当前农业生产迫切需要解决的问题,而在分子水平上阐明植物吸收、转运和储藏Pi的机制是有效解决这个问题的基础。本课题组近期研究发现,一种SPX-MFS家族蛋白VPT1是主要负责向植物液泡中积累Pi的转运体。VPT(SPX-MFS)家族在拟南芥中共有三个成员,分别是VPT1,VPT2和VPT3,它们全部定位在液泡膜上。为了进一步研究VPT家族蛋白的功能,我们通过杂交的方法构建了不同的双突变(vptl/vpt2,vpt1/vpt3,vpt2/vpt3)和三突变(vptl/vpt2/vpt3)。表型和磷含量分析结果显示vptl/vpt2双突变与vptl的单突变的生理特征是相似的,而vpt2/vpt3与野生型没有明显差异。vpt1/vpt3双突变较vpt1单突变则表现出明显的生理差异。vpt1/vpt3双突变体植株的磷含量显著的低于vpt1,并且通过基因回补实验可以消除这种磷含量的差异。通过电生理的实验我们发现vpt1/vpt3磷含量的降低是由液泡储存磷的功能减弱造成的。叶肉细胞的膜片钳数据显示vpt1/vpt3液泡的磷电流要显著的低于vpt1单突变体,而vpt2/vpt3液泡的磷电流与野生型相比并无显著差异。这些数据说明叶肉细胞中VPT1蛋白是最主要的液泡磷酸转运体,在VPT1缺失的情况下,VPT3才开始行使着向液泡中储存磷的功能。另外,vpt1/vpt3植株的磷稳态较vpt1受到了更加严重的破坏,vpt1/vpt3适应环境中磷浓度变化的能力更低,更加难以适应高磷或低磷的胁迫,vpt1/vpt2/vpt3与vpt1/vpt3表型是一致的。此外,vpt1/vpt3出现了明显的败育现象,它所结出的果荚很短,并且种子缺刻现象严重。电镜扫描、化学核染色以及体外花粉萌发实验表明vpt1/vpt3的雄蕊和雌蕊发育并未受到影响。通过磷含量测定,我们意外地发现vpt1/vpt3花组织器官的磷含量要显著的高于对照植株,而这种现象在其他双突变中并未发现,因此推测其败育可能是磷毒害造成的。我们用不同磷浓度的培养液对vpt1/vpt3进行培养发现,随着磷浓度的升高其花组织的磷含量越高且败育的现象也更加严重。当磷浓度达到1.3 mM时,vpt1/vpt3已经很难结出果荚,而磷浓度较低时(1.3μM)则能够结出正常的果荚和种子。我们进一步对花器官的不同部分(雌蕊,雄蕊,花瓣,萼片)的磷含量进行分析,发现vpt1/vpt3花组织器官不同部位的磷含量都要高于对照植株。杂交试验证明,磷含量高的雌蕊是产生败育的原因。我们以野生型做父本,以不同磷浓度培养的vpt1/vpt3做母本进行杂交,并运用化学染色的方法观察体内花粉管伸长的情况。发现花粉管伸长随着母本培养液磷浓度的升高而受到明显抑制,并且体外的花粉管伸长实验与体内的结果一致。这说明磷毒害会严重影响花粉管的伸长并导致败育。植物地上部的磷主要来源于根从环境中吸收的有效磷,这些磷通过植物体内的维管系统进行长距离运输,最终分配到不同的组织来行使其生理功能。因此,我们推测vpt1/vpt3花器官的磷含量较高是由其体内长距离运输的磷较多导致的。通过检测木质液中的磷含量,我们发现vpt1/vpt3木质液中的磷含量要显著高于对照植株。为了进一步确认实验结果,我们通过遗传学的方法制作了vpt1/vpt3/pho1 三基因缺失突变体,PHO1是参与磷在植物体内长距离运输的主要转运蛋白。表型分析结果显示,PHO1的突变可以有效回补vpt1/vpt3败育的表型。这也就说明vpt1/vpt3花器官中磷的过多积累是磷的长距离运输紊乱造成的。因此,VPT家族蛋白对磷在整个植株中的分配也起到关键调控作用,而这种磷稳态在植物的生殖发育中有着举足轻重的地位。砷酸根[As(V)]与磷酸根有着极为相似的化学结构,它可以通过磷酸转运体进入到植物体内,并对植物造成毒害。为了检测VPT家族蛋白是否在植物响应砷胁迫中起到关键作用,我们对vpt突变体进行了砷处理。实验结果显示,vpt1对五价砷毒害有较强的耐受性,同时,与vptl相比vpt1/vpt3(和vpt1/vpt2/vpt3)有着更强的耐砷能力。于此相反,VPT1的过表达植株则表现出对砷毒害敏感的表型。并且,vpt1砷的积累显著低于野生型,而VPT1过表达植株会加剧砷的积累。这些反向遗传学的数据证明,VPT家族蛋白必然参与了植物响应砷毒害的过程。我们以VPT1为对象做进一步研究,通过酵母表达系统分析发现VPT1并不能转运As(V)。这说明VPT1并非通过直接转运砷而参与到植物响应砷毒害过程中的。前期的研究表明VPT1的缺失会导致磷不能转运到液泡而积累在细胞质中,因此细胞质中过量积累的磷会反馈抑制细胞膜上主要的磷转运体PHT1家族基因。qPCR的数据显示与野生型植株相比vpt1中大部分PHT1家族基因的表达都得到了下调,而PHT1家族蛋白的砷转运功能是As(V)进入植物体的主要途径。因此,我们推测vpt1的耐砷能力是其细胞内磷平衡紊乱所致。我们在低磷条件下再次对vptl进行砷处理,发现其耐砷的表型消失了,因此vpt1的耐砷能力是依赖于磷浓度的并与PHT1基因密切相关。为了进一步确认VPT1参与耐砷的分子机制,我们通过qPCR的方法检测了 VPT1应砷毒害的表达模式。实验结果随着砷处理时间的增长VPT1的表达没有明显变化的。考虑到RNA转录水平的变化并不能完全反应基因行使功能的变化,我们在蛋白水平上对VPT1进行了检测。将35S启动的融合有绿色荧光蛋白的VPT1稳定表达植株进行砷处理,通过荧光显微观察我们发现液泡膜上的VPT1随着处理时间的延长会越来越少,但是其定位的模式并未发生改变。砷处理80小时后,液泡上的VPT1较对照处理降低了约60%。因此,植物在遇到砷毒害时会降低VPT1基因的表达量和其蛋白的在液泡膜上的积累量,使得细胞质中的磷水平提高,进而反馈抑制细胞膜上PHT1家族成员的表达,最终缓解砷的毒害。
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其运输到细胞质膜上，可见ＰＴ８的磷酸化在磷吸收的过程中起负调控作用（Ｃｈｅｎ逡逑以0／．，２０１５）。另一研宄发现定位在细胞质中的蛋白ＡＬＩＸ也参与了邋ＰＨＴ１在细胞逡逑内的运输（Ｃａｒｄｏｎａ－Ｌｏｐｅｚｅ／邋0／．，邋２０１５）。与邋ＰＨＦ１邋相反，ＡＬＩＸ邋并没有将邋ＰＨＴ１邋运逡逑送到细胞膜上去发挥功能，而是将ＰＨＴ１转移到液泡中进行降解。ＡＬＩＸ可以与逡逑ＥＳＣＲＴ－ｍ（ＥＮＤＯＳＯＭＡＬ邋ＣＯＭＰＬＥＸ邋ＲＥＱＵＩＲＥＤ邋ＦＯＲ邋ＴＲＡＮＳＰＯＲＴ－１１１）互作，逡逑ＥＳＣＲＴ－丨丨丨在内吞小体（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）整合成为多泡体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ邋ｂｏｄｙ，ＭＶＢ）逡逑过程中起到关键作用，多泡体最终将包含物释放进液泡进行降解。在高磷环境中，逡逑ＰＨＴ１；丨可以脱离细胞膜而被分拣到多泡体中，进而被释放进液泡里完成蛋白降逡逑解的生理过程。在这个运输的过程中，ＡＬＩＸ和ＥＳＣＲ１－ＩＮ是必不可少的。在ａ／／ｘ逡逑基因缺失突变体中，磷的稳态遭到了很大的破坏。这是由于本该降解的ＰＨＴ１；Ｉ逡逑没有被运到液泡，，使得过量的ＰＨＴ１；丨蛋白在细胞上枳累所导致的。由此可见，逡逑植物吸收磷的过程得到了精密的调控。逡逑Ｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ逡逑

钳检测液泡磷电流逡逑磷电流的记录主要参考了本实验前期的研宄方法（Ｌｉｎ常水培条件下生长３周的拟南芥野生型和不同的突变体植叶，用酶解法分离出叶片的原生质体（实验方法见附录尖端将细胞膜刺破释放出液泡。然后将电极插入液泡进。a惖缌骷锹枷低澄�Ａｘｏｎ邋Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ邋７００Ｂ邋Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ邋（泡记录的电极电阻５？６ＭＱ。灌流液为１００ｍＭＨ３Ｐ０４，ｌ和邋５邋ｍＭ邋Ｍｅｓ－ＢＴＰ邋（ｐＨ邋５＿８），浴液为邋１００邋ｍＭ邋Ｈ３Ｐ０４，６．７邋ｍＣｌ２邋（游离邋Ｃａ２＋浓度为邋２邋ｐＭ）和邋５邋ｍＭ邋Ｍｅｓ－ＢＴＰ邋（ｐＨ邋７．０势分别用Ｄ－山梨醇调节５５０邋ｍＯｓｍ和５００邋ｍＯｓｍ。据膜逡�

本文编号：2704670