海洋地衣芽孢杆菌脂肪酶的酶学性质表征及催化机制研究

发布时间：2020-06-09 19:13

【摘要】：甘油单酯脂肪酶是一类专一性地作用于甘油单酯底物的水解酶,其独特的催化特性使其在工业应用中极具应用价值。另外,甘油单酯脂肪酶在哺乳动物生理调节方面也起到了关键的作用。开展工业需求或参与生理代谢关键酶三维结构的研究,有助于理解该类酶的结构与功能关系及丰富酶学理论,具有科学与实际应用研究价值。本课题以海洋地衣芽孢杆菌的甘油单酯脂肪酶Geobacillus sp.12AMOR1(GMGL)为研究对象,研究了重组酶的制备、酶学性质及三维结构的解析,结合定点突变和分子动力学模拟等手段研究及阐述GMGL识别及水解底物的过程。主要研究内容如下:(1)GMGL的制备和酶学性质研究。利用全基因合成技术获得了来源于海洋地衣芽孢杆菌的甘油单酯脂肪酶基因,构建了GMGL原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中实现了高表达,利用金属螯合亲和层析方法对GMGL重组酶蛋白进行“一步法”的分离纯化,SDS-PAGE电泳分析显示目的蛋白条带均一,纯度大于90%。酶学性质表征结果显示:GMGL的最适反应温度为60 ~oC,该酶在70 ~oC的T_(1/2)为60 min;最适反应pH为8.0,在偏碱性的环境中较为稳定。水解甘油单酯底物及酯化甘油与脂肪酸的实验证实,GMGL为甘油单酯脂肪酶。(2)GMGL晶体结构的解析。采用凝胶过滤层析获得更高纯度的GMGL蛋白,并优化获得酶蛋白可衍射的结晶条件:蛋白浓度为12 mg/mL、0.2 M Ammonium sulfate、0.1 M MES monohydrate(pH 6.6)、28%w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 5,000、20 ~oC。通过分子置换的方法解析出分辨率2.19?的GMGL蛋白结构(PDB ID:5XKS)。GMGL结构属于典型的α/β水解酶类,由9个α-helix和9个β-sheet构成。GMGL的催化三联体由Ser97、Asp196和His226组成,氧负离子洞由Phe29和Met98的主链-NH-基组成。(3)GMGL底物选择性的研究。通过晶体学分析,选择了催化口袋中可能影响链长选择性的Leu142、Ile145和Ile170等位点,构建了Leu142Ala、Ile145Ala和Ile170Phe突变体。考察了野生型及突变体作用于不同脂肪酸链长的对硝基苯酚酯底物的k_(cat)/K_m值,结果显示:相对于野生型,Leu142Ala、Ile145Ala和Ile170Phe对于pNP-C6底物的选择性分别有2.3、1.2和2.2倍的提高。(4)GMGL识别及水解底物的过程。分子动力学分析发现单甘酯酶的结构中存在独特的“孔洞结构”,选择孔洞附近的S32、S35、S147和E156氨基酸位点,共构建了12个突变体(S32W/S32V/S32A、S35W/S35V/S35A、S147W/S147V/S147A、E156W/E156V/E156A),并利用硬脂酸单甘酯为水解底物检测酶突变体的水解活力。结果显示:相对于野生型,所有突变体均表现出不同程度的抑制现象,提示该“孔洞结构”可能是参与水解产物甘油的释放通道。综合生化实验数据及生物计算分析,进一步提出了GMGL通过酶的“诱导契合”识别及水解底物的过程。
【图文】：

甘油单酯,花生四烯酸代谢,脂肪酶,烯酸

图 1-1 甘油单酯脂肪酶介导 2-花生烯酸甘油酯信号传导和花生四烯酸代谢[30, 3Fig.1-1 Monoglyceride lipase in 2-arachidonoyl glycerol signaling and arachidonic acmetabolism[30, 31]1.1.2 甘油单酯脂肪酶的工业应用由于甘油单酯脂肪酶特殊的底物选择性，因此可应用在合成高纯度甘油单酯的中。甘油单酯（MG）是一种优质高效的乳化剂和表面活性剂，其完全无毒无害，品工业中应用中没有限制，在精细化工业中使用前景更为广阔，全世界每年需求量10 万吨。MG 按照结构类型可以分为 α-MG 和 β-MG，按照联结的脂肪酸类型可以饱和脂肪酸单酯和不饱和脂肪酸单酯，它们天然油脂中含量特别低，只能通过工业以适应市场需求。MG 是一种多元醇型非离子表面活性剂，能够起到乳化剂、稳分散剂、消泡剂和抗淀粉老化剂的作用。1.1.2.1 甘油单酯作为乳化剂和稳定剂的应用

抑制剂,通用结构,作用机理

底抑制 MGL 的活力。进一步的研究表明 JZL184 抑制 MGL 是通过与催化丝氨酸形价结合物发挥抑制作用的，并且这种结合是一种非可逆结合，不受到水解作用的影响近，Louis 等[53]报道了一种有效抑制剂——O-六氟异丙基氨基甲酸酯（SR48968， 1-3）。通过其与 MGL 的共结晶结果发现，虽然 SAR629 与 KML29 有着相同的离团和哌啶氨基甲酸酯官能团，但该化合物的特点在于哌啶环上的不同取代基，其占化通道的内部。SAR629 是 rMGL 和 hMGL 的有效抑制剂，其 IC50分别为 3.8 nM9 nM[54]。Saario 等[55]发现 N-花生四烯酰基马来酰亚胺（NAM，图 1-3）是一种结构类似于性底物 2-AG 的衍生物，是该系列抑制剂中最有效的化合物，其 IC50为 140 nM。紧，，Matuszak 等[56]通过对各种烷基-苯基 N-取代基的进一步研究证实了这一发现。并现 NAM 和其他 N-取代的马来酰亚胺衍生物是不可逆的 MGL 抑制剂。质谱和诱变表明，NAM 对 hMGL 的抑制是由花生四烯酰基马来酰亚胺基团与 Cys201 和 Cys2生相互作用，使得半胱氨酸的巯基烷基化，从而使得酶丧失活力。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55

【参考文献】