去泛素化酶OTUB2对PCNA调控机制的研究

发布时间：2020-06-10 04:53

【摘要】：泛素(Ub)-蛋白酶体系统(UPS)降解细胞内大多数可溶性蛋白质。在UPS系统中,泛素化修饰是泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)以及泛素连接酶(E3)参与介导的酶促级联反应。去泛素酶(Deubiquitylases,DUBs)调节泛素化修饰,人体内大约有100多种具有活性的DUBs,并且许多与人类疾病有关,如癌症和神经退行性疾病。其中,卵巢肿瘤结构域(OTU)家族是重要的信号级联调节因子。相比于其他去泛素化酶亚家族成员,OTU亚家族成员不同于其他去泛素化酶亚家族成员的独特之处是OTU亚家族大部分成员都具有很强的泛素链识别特异性。例如,OTUD7B通过去泛素化TRAF3调节NF-κB信号传导,OTUB1抑制非经典的依赖泛素的DNA损伤,OTULIN可以预防人和小鼠中与TNF相关的全身性炎症。目前人源OTU家族共发现16个具有去泛素化酶催化活性的成员,主要可分为Otubains、A20-like OTUs和OTUDs和OTULIN四个亚家族,该家族成员主要通过高度保守的OTU结构域行使其去泛素化酶的催化活性,且该家族成员对底物的去泛素化修饰具有链型特异性。其中去泛素化酶OTUB2(OTU Deubiquitinase,Ubiquitin Aldehyde Binding 2)编码234个氨基酸,分子量为28KD,在Otubain亚家族中具有很高的同源性,与其它DUB类似其具有典型的半胱氨酸酶活中心,催化核心结构域为Cys51,His224,Asn226。已知在2014年的一篇文献中发现OTUB2参与调节RAD6-RAD18介导的DNA损伤修复,在细胞内敲除OTUB2后,DNA发生损伤时能够快速募集53BP1和RAP80到达DNA损伤位点完成DNA损伤早期的非同源重组修复。OTUB2还能参与其他非典型的DNA损伤修复途径,但是其机制尚不清楚。增殖细胞核抗原(Proliferation Cell Nuclear Antigen,PCNA)是1978年在SLE(系统性红斑狼疮)患者的血清中由Miyachi等首先发现并命名的,且发现其在增殖细胞及肿瘤细胞内高表达。PCNA是细胞增殖的分子标记物,其蛋白水平随着细胞周期变化,在G1期和S期蛋白水平达到峰值。PCNA作为一种肿瘤标志物能够参与翻译后的信号传导,并且受多种翻译后修饰。在过去的十年里,越来越多的研究发现PCNA具有促进细胞生长的功能。DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变,并导致遗传特征改变的现象。2002年Nature的一篇文献中证明RAD6途径是真核细胞中复制时DNA修复的核心,但是其机制及调控仍然知之甚少。该途径的两个至关重要的关键因子是泛素结合酶RAD6,MMS2-UBC13异二聚体,并且由RING指蛋白RAD18和RAD5招募到染色质中。PCNA是DNA聚合酶的辅助蛋白,是参与DNA合成和修复的重要底物。PCNA通过RAD6和RAD18进行单泛素化,通过Lys63泛素链的修饰完成多聚泛素化修饰,PCNA的多聚泛素化修饰在DNA损伤修复中的作用要远远高效于PCNA的单泛素化修饰。科学家发现PCNA的K63型泛素化修饰在依赖RAD6的DNA损伤修复中至关重要。并且已知USP1能够去除PCNA的单泛素化,而去除其多聚泛素化的DUB未知。到底是E3影响了泛素链从而影响DNA损伤修复还是DUB影响泛素链从而影响DNA损伤修复尚不清楚。由此激发了我们研究E3和DUB对DNA损伤修复的兴趣。我们的研究发现OTUB2能够通过去泛素化酶的作用调控PCNA。本文主要探讨去泛素化酶OTUB2与增殖细胞核抗原PCNA的相互作用及其对肿瘤细胞增殖的影响。为了研究PCNA与OTUB2之间存在的联系以及对生命活动的影响,我们进行了一系列的实验。我们首先通过免疫共沉淀和免疫印迹方法发现去泛素化酶OTUB2与PCNA具有相互作用。在He La细胞系内敲低OTUB2发现OTUB2能够影响PCNA的多聚泛素化修饰,结果表明OTUB2能够去除PCNA的多聚泛素化修饰,在293T细胞中过表达OTUB2和OTUB2-C51S作泛素化实验发现,OTUB2能够去除PCNA的泛素化修饰而OTUB2-C51S酶活突变体没有去除其泛素化修饰,因此OTUB2发挥去泛素化酶的作用需要依赖其半胱氨酸酶的活性,这说明OTUB2能够去除PCNA的多聚泛素化修饰并且依赖其酶活中心。过表达OTUB2后PCNA的表达没有变化,说明OTUB2并不影响PCNA的稳定性。综上所述,OTUB2与PCNA之间具有相互作用,且OTUB2能够去除PCNA的多聚泛素化修饰,不影响PCNA的稳定性。为研究DNA损伤修复过程中DUB的重要作用提供了新的方向。去泛素化酶与泛素酶在生命体内共同参与众多的生物学过程。其中去泛素化酶中的OTU亚家族成员的典型特征是其主要通过高度保守的OTU结构域行使去泛素化酶的催化功能。其中,OTUD4作为其中一员,目前的研究很少。已知的研究发现科学家采用斑马鱼作为模式生物敲低斑马鱼胚胎中的Rnf216或Otud4,发现斑马鱼的眼、视顶盖及小脑发育缺陷,提示OTUD4可能在胚胎发育过程中发挥着至关重要的作用。为研究OTUD4在动物整体水平的功能,我和刘雯师姐一起共同合作,基于Loxp-Cre系统构建OTUD4基因全身性敲除小鼠。应用Loxp-Cre系统构建去泛素化酶Otud4基因敲除小鼠利用Loxp-Cre系统原理,将Otud4基因中的4号外显子选为打靶序列,将两个Lox P位点分别设在E4的两端,经打靶载体转入ES细胞、阳性克隆筛选、囊胚注射等过程,得到嵌合体小鼠,再将嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠交配进行繁育,最终得到杂合子小鼠并进行自交得到新生F1代小鼠。然后利用PCR进行基因型鉴定,使用免疫印迹(WB)技术从蛋白水平检测OTUD4在各组织器官中的表达,以明确基因敲除小鼠是否构建成功。对各基因型小鼠进行数目统计分析明确其是否符合孟德尔遗传定律,是否具有胚胎致死表型。解剖小鼠分析主要组织器官有无明显发育异常,利用HE染色分析是否具有自发的病理改变。通过葡萄糖耐受实验分析基因敲除小鼠是否具有代谢异常等。基因型鉴定和WB检测结果显示Otud4基因敲除小鼠模型建立成功。杂合子小鼠自交后各基因型比例符合孟德尔定律,提示Otud4基因敲除小鼠非胚胎致死。各组织器官大小无显著性差异,HE染色并无异常,且Otud4基因敲除后不影响小鼠的血糖稳态。应用Loxp-Cre系统成功构建了Otud4基因敲除小鼠,并且小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷,各器官无显著病理性变化,血糖代谢无异常。综上所述,利用Loxp-Cre系统构建成功了OTUD4小鼠,为进一步研究OTUD4体内的功能奠定了基础。
【图文】：

泛素化,级联反应

图 1 泛素化修饰的级联反应图 (Chen and Lu, 2015)泛素化酶的研究物体内的蛋白质处于动态平衡之中，，少不了去泛素化酶的作用，泛素化酶两者之间相互调节共同维护生物体内的蛋白质稳态。去泛素化酶

流程图,小鼠模型,流程图,剪取

Otud4-/-小鼠模型构建流程图
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q75

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