α-L-鼠李糖苷酶HFM-Rha78的酶学性质及其催化作用研究
发布时间：2020-06-13 07:39
【摘要】：α-L-鼠李糖苷酶特异性地切割天然产物末端的α-鼠李糖基,有效地提高了这些天然产物的生物活性和生物利用度。本课题组通过基于保守基序的PCR和人粪便宏基因组高通量测序,获得了具有独立知识产权的新型α-L-鼠李糖苷酶HFM-Rha78。该酶分子质量为85.5kD,等电点为5.58。在克隆到载体pET-28a时,α-L-鼠李糖苷酶HFM-Rha78的N-末端携带(His)_6标签。本论文对其酶学性质和生物转化进行系统的研究,为该酶的进一步应用提供依据,对于挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶资源具有重要的意义和价值。生物信息学分析结果表明,HFM-Rha78的亲水性氨基酸分布均匀,无明显的疏水区,且总亲水性平均系数为㧟0.425,表现出亲水性。N端的原始剪切位点分值为0.135,信号肽平均分值为0.205,综合剪切位点分值为0.185,皆处于较低水平,说明该酶缺乏信号肽。HFM-Rha78的2级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,分别占33.43%和41.47%,其余为β转角结构和延伸链,分别占6.8%和18.31%。该酶的催化广义酸和广义碱均是谷氨酸,催化残基高度保守。以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR)为底物,紫外-可见分光光度法测定HFM-Rha78的酶学性质。结果表明,最适反应条件为:磷酸缓冲液pH 6.5,反应温度50℃。该酶在46℃以下保温30 min,不会影响其酶活性,说明其具有一定的热稳定性。HFM-Rha78能普遍耐受低浓度(1%以下)的有机溶剂,且1%~5%的异丙醇和1%的β-巯基乙醇还能够显著提高其酶活性。酶动力学实验证明HFM-Rha78对pNPR的亲和性较弱。采用高效液相色谱法,研究HFM-Rha78对黄酮苷类化合物芦丁、柚皮苷和橙皮苷的催化活性。结果表明,该酶均能专一性地将3种底物分别转化为异槲皮素、樱桃苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷,转化效率为柚皮苷(29)芦丁(29)橙皮苷。该酶水解芦丁、柚皮苷和橙皮苷的最适温度分别为39℃、45℃和42℃,最适pH为7.5、6.5和5.5~6.0。柚皮苷最适反应时间最短,为2 h,芦丁及橙皮苷的最适反应时间为12 h。
【图文】：
第一章 文献综述构上，异槲皮素仅比芦丁少 1 个鼠李糖，，其具有的抗氧化、抗炎、抗突变、抗病毒等其他药理活性却明显高于芦丁，具有更好的市场开发前景[6]。异槲皮素比芦丁易吸收，是治疗心肌缺血、脑缺氧和缺血性疾病的抗血栓药物的材料之一，作用效果较芦丁更明显：能通过阻碍晚期糖基化终产物(advanced glycation end-products, AGEs)合成来调节血糖、控制糖尿病及其血管并发症[18]；对 9 种人肿瘤细胞系的体外研究表明，异槲皮素对各种癌细胞系的抑制作用比槲皮素和芦丁强，特别是神经胶质瘤细胞、卵巢腺癌细胞和乳腺癌细胞[19]。异槲皮素进入人体小肠后脱去配体糖基[20]，其产物通过抑制黄嘌呤氧化酶减少体内尿酸生成速度，降低了高尿酸血症的发病率，减少由其引发的痛风和慢性肾病的风险。水解芦丁的另一个产物——L-鼠李糖是一种甜度为蔗糖 1/3 的可食用甲基戊糖[21]，有研究[22]证实，L-鼠李糖常作为甜味剂添加至面包、肉制品等食品中，也可作为合成强心药物的中间体等，并具有明显的抗癌作用。
图 1.2 α-L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷Fig.1.2 Process of α-L-rhamnosidase hydrolyzed naringin1.2.3 橙皮苷及橙皮素-7-O-葡萄糖苷的应用价值橙皮苷是一种存在于自然界中的二氢黄酮，经 α-L-鼠李糖苷酶水解生成鼠李糖和橙皮素-7-O-葡萄糖苷（图 1.3）。橙皮苷在人体中的生物利用率也低于橙皮素-7-O-葡萄糖苷[26]。α-L-鼠李糖苷酶水解橙皮苷常用于减轻橙皮苷晶体造成的饮品浑浊[4]和提升葡萄酒的香气风味[5]。在 10%的乙醇溶液中，橙皮素-7-O-葡萄糖苷的溶解度较橙皮苷提高了55倍[27]，在水中的溶解度是橙皮苷的50倍以上[26]，这使橙皮素-7-O-葡萄糖苷更易被利用至药物制剂中，也更易被人体吸收。橙皮苷和橙皮素-7-O-葡萄糖苷都具有抑制人肠道麦芽糖酶和 HMG-CoA 还原酶作用，2 种作用方式中后者的影响明显更大。治疗Ⅱ型糖尿病所使用的降糖药主要成分是糖苷酶抑制剂[28]，橙皮素-7-O-葡萄糖苷对人肠道麦芽糖酶的抑制作用比橙皮苷抑制作用强 1.7 倍[27]，可以作为有效的糖苷酶抑制剂控制餐后血糖峰值，延缓
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55
【图文】：
第一章 文献综述构上，异槲皮素仅比芦丁少 1 个鼠李糖，，其具有的抗氧化、抗炎、抗突变、抗病毒等其他药理活性却明显高于芦丁，具有更好的市场开发前景[6]。异槲皮素比芦丁易吸收，是治疗心肌缺血、脑缺氧和缺血性疾病的抗血栓药物的材料之一，作用效果较芦丁更明显：能通过阻碍晚期糖基化终产物(advanced glycation end-products, AGEs)合成来调节血糖、控制糖尿病及其血管并发症[18]；对 9 种人肿瘤细胞系的体外研究表明，异槲皮素对各种癌细胞系的抑制作用比槲皮素和芦丁强，特别是神经胶质瘤细胞、卵巢腺癌细胞和乳腺癌细胞[19]。异槲皮素进入人体小肠后脱去配体糖基[20]，其产物通过抑制黄嘌呤氧化酶减少体内尿酸生成速度，降低了高尿酸血症的发病率，减少由其引发的痛风和慢性肾病的风险。水解芦丁的另一个产物——L-鼠李糖是一种甜度为蔗糖 1/3 的可食用甲基戊糖[21]，有研究[22]证实，L-鼠李糖常作为甜味剂添加至面包、肉制品等食品中，也可作为合成强心药物的中间体等，并具有明显的抗癌作用。
图 1.2 α-L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷Fig.1.2 Process of α-L-rhamnosidase hydrolyzed naringin1.2.3 橙皮苷及橙皮素-7-O-葡萄糖苷的应用价值橙皮苷是一种存在于自然界中的二氢黄酮，经 α-L-鼠李糖苷酶水解生成鼠李糖和橙皮素-7-O-葡萄糖苷（图 1.3）。橙皮苷在人体中的生物利用率也低于橙皮素-7-O-葡萄糖苷[26]。α-L-鼠李糖苷酶水解橙皮苷常用于减轻橙皮苷晶体造成的饮品浑浊[4]和提升葡萄酒的香气风味[5]。在 10%的乙醇溶液中，橙皮素-7-O-葡萄糖苷的溶解度较橙皮苷提高了55倍[27]，在水中的溶解度是橙皮苷的50倍以上[26]，这使橙皮素-7-O-葡萄糖苷更易被利用至药物制剂中，也更易被人体吸收。橙皮苷和橙皮素-7-O-葡萄糖苷都具有抑制人肠道麦芽糖酶和 HMG-CoA 还原酶作用，2 种作用方式中后者的影响明显更大。治疗Ⅱ型糖尿病所使用的降糖药主要成分是糖苷酶抑制剂[28]，橙皮素-7-O-葡萄糖苷对人肠道麦芽糖酶的抑制作用比橙皮苷抑制作用强 1.7 倍[27]，可以作为有效的糖苷酶抑制剂控制餐后血糖峰值，延缓
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【学位授予年份】：2019
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1 吴U嗚
本文编号：2710860
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