CHO细胞培养过程中单克隆抗体碱性电荷变体的表征与优化

发布时间：2020-06-13 11:57

【摘要】：电荷异质性是抗体的一个关键质量属性,在抗体药物的研发和生产过程中被极大重视。虽然许多引发电荷变体的体外化学机制较为清楚,但在细胞培养过程中由于涉及多重因素,特别是各种培养基组分以及它们之间的相互作用,造成电荷变体形成的根本原因尚不清楚,因此,迫切地需要更多的研究来深入阐释抗体电荷变体的形成原因及相关机制。前期在CHO(Chinese hamster overy,CHO)细胞无血清培养基开发过程中发现,添加尿苷可大幅提高最大活细胞密度以及抗体的表达量。本研究在验证此结果的基础上,首先分析了尿苷的添加对抗体电荷变体、糖基化、聚体、片段化、疏水性等质量属性的影响,研究发现尿苷的加入并未改善抗体碱性电荷变体含量极高的问题。为此,进一步考察了流加培养基中添加尿苷后生产的抗体中碱性电荷变体的组成,结果发现在碱性电荷变体组成中虽然赖氨酸变体含量大幅减少,但抗体Fab(Fragment of antigen binding,Fab)区甲硫氨酸和色氨酸的氧化比例增多。通过过氧化氢和AAPH(2,2'-Azobis(2-methyl-propionamidine)dihydrochloride,AAPH)孵育实验证实,甲硫氨酸氧化和色氨酸氧化均是mAbl抗体碱性电荷变体形成的重要因素。随后,通过在细胞培养基中添加牛磺酸、柠檬酸铁铵、N-乙酰-L-半胱氨酸、水飞蓟素和硫辛酸等抗氧化剂希望降低碱性电荷变体的含量,发现牛磺酸不仅使抗体碱性电荷变体的含量降低,并提高主峰的含量,而且还使最大活细胞密度略有提高,抗体产量显著增加,同时添加牛磺酸对抗体的糖基化、聚体以及片段化等质量属性影响较小。进一步研究表明,牛磺酸使抗体碱性电荷变体减少的关键在于抗体的赖氨酸变体和氧化变体的减少,实时荧光定量PCR和无细胞孵育实验显示,牛磺酸可能通过促进碱性羧肽酶的表达使赖氨酸变体减少。胞内活性氧水平和培养液氧化还原电位的检测结果显示,牛磺酸可能是通过抑制活性氧的形成以及提高培养液的还原性来减少氧化变体的生成。本研究结果为将来调控生产过程中抗体电荷异质性的产生、提高抗体药物的产量和质量提供指导。
【图文】：

抗体重链,肽酶,碱性,赖氨酸

１．４．２赖氨酸变体逡逑所有鼠及人ＩｇＧ重链终止于相同的由三个氨基酸组成的序列：脯氨酸－甘氨酸－赖氨逡逑酸。如图１．３所示，通常将Ｃ末端赖氨酸不完全切除的情况称为赖氨酸变体。赖氨酸的逡逑切除被认为由碱性羧肽酶催化所致，羧肽酶是一种锌结合酶，锌是己知的羧肽酶的主要逡逑辅助因子之一，可以水解蛋白质的单个Ｃ末端氨基酸ｔ％。因此，细胞培养基中锌浓度的逡逑波动会影响羧肽酶活性，导致Ｃ末端赖氨酸水平的变化％１。不同Ｃ末端赖氨酸的切除逡逑导致抗体混合物中蛋白的Ｃ末端含有０、１和２个赖氨酸残基，由于赖氨酸带正电，相逡逑对于主峰抗体，含一个或两个赖氨酸残基的抗体等电点更高，因此赖氨酸变体是一种碱逡逑性电荷变体。逡逑！逦＾＾－Ｂａｓｉｃ邋Ｃｐ邋ｉ00Ｈ逦ｊ逡逑ｊ逦（Ｌｙｓｊ逦！邋Ｐｒｏｌｉｎｅ邋ａｍｉｄａｔｉｏｎ邋！邋！逡逑■逦ｉＳｏｉ邋—＾逦逡逑１逦ｉ邋Ｌｙｓｉｎｅ邋ｃｌｉｐｐｉｎｇ邋ｊ逦／逡逑逦，逡逑图１．３抗体重链Ｃ端修饰示意图Ｗ邋（Ｂａｓｉｃ邋Ｃｐ：碱性竣肽酶）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｔｈｅ邋Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｈｅａｖｙ邋ｃｈａｉｎ．邋（Ｂａｓｉｃ邋Ｃｐ：邋Ｂａｓｉｃ邋ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）逡逑赖氨酸变体不会影响抗体功能，但其是否对药物生物学活性有影响存在争议。由于逡逑重链Ｃ末端位置离抗原抗体结合域及与Ｆｃ受体、补体等效应分子相互作用的位点相对逡逑较远

尿苷,细胞,流加培养,细胞生长

３．３结果与讨论逡逑３．３．１尿苷对细胞生长和抗体表达的影响逡逑图３．１为两组培养过程屮ｒＣＩ－ＩＯ细胞的生长、细胞活率以及抗体产量的差异。如阁逡逑３．１邋ａ所示，整个培养周期为１２天，添加ＲSD的实验组最大活细胞密度相较于对照组打逡逑较大提高，对照组在培养第７天达到最火活细胞密度，力１０．０ｘ１邋0６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，实验组eA火逡逑活细胞密度则在第８天达到１５．４ｘｌ0６ｃｅｎｓ／ｍｌ。此外，，培养坫中以SD的添加还有利于培养逡逑后期细胞活率的维持。就对照组而Ｖｆ，「丨第７人细胞达到最大活细胞密度起，此后便进逡逑入衰亡期，最大活细胞密度下降，从培养第１０天起细胞活率跌至９０％以下。而对了－实逡逑验组，尿苷的添加不仅大幅提高了最大活细胞密度，而且还减缓了培养后期细胞的衰亡，逡逑很好地维持细胞活率，在第１２天培养结g?时
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q813.11

【相似文献】