红树林来源的哈茨木霉bgl基因表达及酶学性质研究

发布时间：2020-06-14 09:39

【摘要】：β-葡萄糖苷酶(β-D-glucoβyranoside glucohydrolases,E.C.3.2.1.21)能够特异性催化水解小分子寡糖、烃基以及芳香基团非还原性末端β-糖苷键生成葡萄糖,其作为纤维素酶的组分中主要的限速酶,对高效利用生物质碳源有着重要意义。除此之外其在食品加工、养殖、生物医学、种植等领域都有着重要使用价值,因此新型β-葡萄糖苷酶资源的开发具有深远的生产意义。本试验旨在通过从海南红树林环境中筛选出新型β-葡萄糖苷酶基因并通过研究其酶特性挖掘该酶资源的应用潜力。主要研究结果如下:1.红树林土壤中产β-葡萄糖苷酶真菌的筛选、分离及鉴定试验采用七叶素苷平板法从海南红树林土壤中成功筛选出9株具有明显β-葡萄糖苷酶活性的真菌,并选取其中一株活性较高真菌H1进行后续实验,该菌在微晶纤维素诱导下,发酵液上清中酶活达到了 19.1 U/ml;菌株H1经过形态学观察和ITS序列测序鉴定属于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。2.哈茨木霉bgl基因的克隆及在其在毕赤酵母中的表达以NCBI数据库中哈茨木霉IOC 3844的bgl基因(GenBank登录号为:KU201604.1)为模板设计引物,利用反转录PCR从野生菌株H1中扩增得到完整的bgl基因,以pPICZαA为表达载体将H1 bgl基因转入毕赤酵母X33表达并测定最佳产酶周期,结果表明,H1 bgl片段全长1398 bp,经比对与数据库中哈茨木霉IOC 3844β-葡萄糖苷酶同源性最高,达到96.07%,没有发现100%一致率的序列。产酶实验测定最佳发酵周期为6d,最高活性为3.09 U/ml。3.哈茨木霉H1 bgl1蛋白的分离纯化及其酶特性研究试验通过阴离子交层析成功纯化H1bgl蛋白,并用SDS-PAGE和BCA法分别检测蛋白纯度和浓度,最后以pNPG为底物分别测定不同温度和pH下H1bglβ-葡萄糖苷酶活性及酶反应动力参数,结果表明,纯化后酶液蛋白浓度为0.106 mg/ml,酶蛋白比活力为14 U/mg,SDS-PAGE检测无明显杂带,分子量约80kD。最佳反应pH为7.0,温度为55℃,米氏常数Km=1.47 mM、专一性常数Kcat/Km=13.56(/s/mM)。综上所述,试验成功从红树林哈茨木霉中发现了一种新型β-葡萄苷酶资源,该酶具有优秀的碱性环境适应性,但其催化效率相对较弱,有待于进一步改造提升。
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55
【图文】：

图２菌株在七叶苷平板上产生的沉淀圈逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ邋ｒｉｎｇ邋ｐｒｏｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｓｔｒａｉｎ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｅｓｃｕｌｉｎ邋ｐｌａｔｅ逡逑表６七叶素苷板沉淀圈测定结果逡逑Ｔａｂｌｅ邋６邋Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｅｓｃｉｎ邋ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ邋ｐｌａｔｅ邋ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ邋ｒｉｎｇ逡逑逦沉淀圈直径（ｃｍ）逦颜色深浅逡逑１．７９土邋０．０６逦＊＊＊＊逡逑１．５７邋土邋０．０３逦＊＊＊＊逡逑１．７３邋土邋０．１２逦＊＊＊＊逡逑０．７４＋０．０４逦…逡逑２逦１．１７土邋０．０４逦＊＊＊逡逑０．９３＋０．０２逦…逡逑０．６１邋土邋０．０１逦＊＊逡逑１．３９邋土邋０．０６逦…逡逑逦１．４１邋土邋０．１３逦…逡逑注：表示颜色深浅，越多表示颜色越深。逡逑

图３对硝基苯粉标准曲线逡逑Ｆｉｇ邋３邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ逡逑．２．２发酵液酶活测定逡逑将上述菌株以相同接种量接入发酵培养基进行同期发酵，每隔２４邋ｈ测定发酵逡逑上清中Ｐ－葡萄糖苷酶活性，共发酵７邋ｄ，选取各菌株发酵周期内测定酶活最高值逡逑行对比，有３株菌株上清液中检测到高活性，结果如表７所示。逡逑表７发酵液（６邋ｄ）上清中（５－葡萄糖昔酶活性逡逑Ｔａｂｌｅ邋５邋Ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ邋ｉｎ邋ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ邋ｏｆ邋ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｂｒｏｔｈ邋（６邋ｄ）逡逑株编号逦最高酶活力（Ｕ／ｍｌ）逡逑－ｌ逦１２．８５邋土０．０４逡逑－ｌ逦１９．１０＋０．０６逡逑－２逦１０．７４逦土０．０３逡逑－ｌ逦—逡逑－２－２逦—逡逑－ｌ逦—逡逑

【参考文献】

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4 杨震国;香红星;王蕾;;饲用酶制剂的研究进展[J];饲料研究;2012年01期

5 王春燕;刘四新;高阳;周艳艳;陈涛涛;;红树林土壤纤维素酶产生菌筛选及产酶条件研究[J];食品与生物技术学报;2011年01期

6 何仁发;李明月;王娟;田峰;叶波平;;木榄根际土壤来源的曲霉属真菌F5及其抗菌活性代谢产物[J];菌物学报;2010年05期

7 张彩英;胡国良;曹华斌;;反刍动物瘤胃内环境的特点及调控措施[J];中国畜牧兽医;2010年04期

8 陈卫红;李多川;;嗜热真菌热稳定性β-葡萄糖苷酶的克隆表达、纯化及酶学性质[J];细胞生物学杂志;2009年04期

9 赵林果;孟鹏;李丽娟;余世袁;;利用七叶灵显色技术检验和判断β-葡萄糖苷酶的研究[J];食品与发酵工业;2008年12期

10 姚海儒;王春景;;复合酶在仔猪小麦型日粮中的应用[J];黑龙江畜牧兽医;2008年07期

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9 王志超;哈茨木霉cbh1基因的克隆及在酿酒酵母中的表达[D];哈尔滨工业大学;2014年

10 王丽香;海南红树林保护法律制度研究[D];海南大学;2014年

本文编号：2712596