水稻氨基酸转运体基因OsLHT1的克隆与功能研究

发布时间：2020-06-14 12:05

【摘要】：氮作为大量元素,植物生长发育必不可少。硝酸盐和铵盐是土壤中氮的主要存在形式。最近研究表明土壤中少量氨基酸也可以被植物直接利用。从而支持植物生长、发育。在我国氮肥的大量使用增加了农作物产量,但随之生态环境也遭受到了严重破坏,为了更好的解决环境污染这一严峻问题,氮源转运研究己经成为了热点,就目前而言氨基酸转运蛋白的研究主要集中在拟南芥上,水稻氨基酸转运蛋白的研究很少。酵母互补实验首次报道OsLHT1为组氨酸转运体,但基因功能尚不清楚。本研究的主要目的是分析OsLHT1的基因功能。主要结果包括:1.使用CRISPR/Cas9基因编辑技术,获得了os1ht1-和os1ht1-2两个突变体,表型分析发现,OsLHT1基因功能丧失抑制了水稻根和茎的生长,叶片出现明显褐色斑点表型,植物出现早衰迹象,种子千粒重,结实率等产量相关数据显著降低从而间接说明了OsLHT1影响水稻发育。2.双电极电压钳技术分析了 OsLHT1在爪蟾卵母细胞的底物选择性。发现OsLHT1可以转运碱性、中性和酸性等多种氨基酸。与它的拟南芥同源基因AtLHT1不同的是,OsLHT1对酸性和中性氨基酸具有更强的转运活性。在检测的11种氨基酸中,OsLHT1对Asn的转运活性最强。3.QRT-PCR实验数据分析表明,幼苗期根组织部位,分生区有最高表达量,茎和叶的表达量相比根较低,抽穗期OsLHT1基因在水稻根、茎、叶鞘、旗叶和穗等组织部位均有表达,其中旗叶中表达量高于其他组织。4.水稻原生质体的瞬时表达系统表明OsLHT1于质膜上表达。进一步说明了OsLHT1在膜上发挥重要的功能。5.为了验证植物吸收氮与表型间的关系,进行了水培氨基酸,硝酸盐吸收实验,结果表明水稻根发育与硝酸盐密切相关而确切转运关系需要更多数据证明,而OsLHT1与氮源的关系复杂难以解释清楚,植物总氮测表明OsLHT1可能参与了氮源吸收,以及氨基酸向上转运过程。具体转运,以及吸收需要后续更多实验验证。综上所述,我们的研究结果表明,OsLHT1是一种氨基酸转运蛋白,具有广泛的底物特异性,对中性氨基酸和酸性氨基酸有选择性,OsLHT1功能的破坏明显抑制了水稻的生长和繁殖。为了进一步探究OsLHT1功能以及推动氨基酸转运体进展研究提供了一些可靠数据。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S511;Q943.2
【图文】：

ＮＣＢＩ邋ＢＬＡＳＴ检索得到拟南芥、玉米、短柄草、高粱和水稻的同源家族基因。１０个拟逡逑南芥、１６个玉米、１４个高梁、９个短柄草和６个水稻家族蛋白序列使用Ｍｅｇａ邋６．０的进逡逑化树构建方法构建进化树（图３－１邋Ａ）。红色的三角形标志着ＯｓＬＨＴｌ，结果显示ＯｓＬＨＴｌ逡逑与邋ＺｍＮＰ＿００Ｉ１４Ｉ３６４、ＳｂＸＰ＿０２１３２０８６０、ＢｄＸＰ＿００３５７３３２６、ＡｔＬＨＴ２邋进化关系比较相逡逑近。为了更好地了解ＬＨＴ家族蛋白的保守结构特征，利用在线工具Ｍｅｍｅ来识别编码逡逑的ＬＨＴ家族中的保守基序，并且每个基序宽度被限制在３－５０个残基之间。每个保守序逡逑列由不同的颜色框表示。基序的顺序与它们在单个蛋白质序列中的位置相对应．结果显示逡逑有十个保守结构被鉴定出，这对氨基酸转运体研究提供了一些理论依据。逡逑２９逡逑

逦水稻l#基酸转运体基因Ｃ＞ｓＺｊＶ７７的交杧与功期■研究逡逑名为１１３，邋Ｆ１代种子在０．５邋ｍＭＣａｄ２溶液中培养四天观察表型，发现其产生分离，分离逡逑比（长根：短根）约为３：１，说明该突变表型为隐性遗传（如图３－２）。逡逑灥逡逑图３－２黄化粘突变体表型分析逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｕｔａｎｔ逡逑注：野生型和突变体水稻种子在含０．５邋ｍＭＣａＣｋ的溶液漂浮的网上培养５ｄ。比例尺为１厘米。逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｓｅｅｄｓ邋ｏｆ邋ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｎｔ邋ｐｌａｎｔｓ邋ｗｅｒｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｉｎ邋ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ邋ｗａｔｅｒ邋ｉｎ邋ｄａｒｋｎｅｓｓ邋ａｔ邋２８°Ｃ邋ｆｏｒ邋３邋ｄａｙｓ，逡逑ａｎｄ邋ｔｌｉｅｎ邋ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ邋ｔｏ邋ａ邋ｎｅｔ邋ｆｌｏａｔｉｎｇ邋ｏｎ邋ａ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ邋ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋０．５邋ｍＭ邋ＣａＣｈ邋ｆｏｒ邋５邋ｄ邋（１２－ｈ－ｌｉｇｈｔ邋ａｎｄ逡逑１２－ｈ－ｄａｒｋ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）．邋Ｂａｒ＝ｌｃｍ．逡逑３．２．２邋Ｍｕｔｍａｐ定位突变基因逡逑我们用无菌水将４００颗ＦＩ代种子在２８°Ｃ暗培养箱中培养３天，然后将发芽种子摆逡逑包含０．５ｍＭＣａｃｌ２溶液的网上２８°Ｃ培养箱中培养，五天后观察表型，产生了根发育受抑逡逑制表型，长根：短根的分离比约为３：１，选取短根的种子，提取ＤＮＡ，送公司进行Ｍｕｔｍａｐ逡逑定位（重复三次）

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本文编号：2712757