嗜根考克氏菌DC2201翻译延伸因子P基因的克

发布时间：2020-06-16 14:57

【摘要】：EF-P(Elongation factor P)是广泛存在于细菌中的蛋白质翻译延伸因子,其主要功能是减缓由新生肽链上的聚脯氨酸序列引起的核糖体翻译延宕并促进肽键的合成。此外,EF-P蛋白的翻译后修饰对其功能的发挥起着重要的作用。目前国内外鲜见有关放线菌纲EF-P蛋白的翻译后修饰方式的研究报道,阐明其翻译后修饰方式对其生命活动的研究具有重大的生物学意义。本论文选取嗜根考克氏菌DC2201为研究材料,通过大肠杆菌异源表达其EF-P蛋白,并利用重组蛋白EF-P作为免疫抗原制备抗EF-P重组蛋白的单克隆抗体,获得的单克隆抗体可用于钓取嗜根考克氏菌DC2201天然蛋白EF-P,以期为解析其翻译后修饰方式奠定实验基础。具体内容及结果如下:1嗜根考克氏菌DC2201 EF-P蛋白的生物信息学分析、表达及鉴定首先经生物信息学分析,efp基因全长为564 bp,编码氨基酸187个,蛋白质理论分子量为21 kDa左右,为亲水性的酸性细胞质蛋白。其主要的二级结构是β折叠;通过对其系统进化分析,表征EF-P的保守性较高。其次利用分子生物学的手段成功构建了重组克隆载体pMD19-T-efp以及重组表达载体pET-29a(+)-efp,且通过诱导表达、镍离子亲和层析柱纯化及SDS-PAGE、MALDI-TOF-TOF鉴定,获得了大小约为25 kDa的重组蛋白EF-P。2重组蛋白EF-P诱导表达条件的优化优化表达条件(诱导起始菌体浓度、诱导温度、IPTG终浓度、诱导时间)以获得大量可溶性目的蛋白。最终确定其表达优化条件是:在OD_(600nm)=0.4,诱导温度为20℃时,以终浓度为0.7 mmol/L的IPTG对含有重组表达载体的表达宿主诱导6 h。3抗EF-P重组蛋白的单克隆抗体的制备以纯化的EF-P重组蛋白作为免疫抗原免疫Balb/c小鼠,进行细胞融合、阳性杂交瘤细胞的筛选、亚克隆筛选单细胞,最终通过体内诱生法成功获取5株小鼠腹水,且腹水效价在1:128000至1:512000之间。对其中的3D3号腹水进行分离纯化及鉴定,最终获得纯度较高、特异性较好的抗EF-P重组蛋白的单克隆抗体。上述研究结果为后续研究嗜根考克氏菌DC2201天然EF-P翻译后修饰方式、探究EF-P的翻译后修饰对嗜根考克氏菌DC2201的生物学意义奠定了物质基础。
【学位授予单位】：江西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;Q93
【图文】：

结构示意图,结构域,细菌

的数量大约为 EF-G 的十分之一，并且每 10 个核糖体大约配有一个 EF-P[12]，基于此可推断 EF-P 并不是每个核糖体的翻译延伸过程都参与作用。另外细菌的 EF-P 与真核生物的 eIF5A 属于同源蛋白质。两者具体的结构如图 1-1[11]所示：对比两者可知，eIF5A 仅有两个结构区域，而 EF-P 存在三个结构区域。EF-P 的 N-末端结构域 I 和 II 相当于 eIF5A 其中的 N-和 C-末端结构域，而另外的 C 末端结构域 III 存在于细菌 EF-P 中，使得 EF-P 整体类似于 L 形的tRNA[11-13]。一方面，细菌 EF-P 的结构域 II 和 III 之间的高结构同源性表明 EF-P中的另外的结构域 III 可能是由于重复而产生，其中 C-末端结构域在细菌 EF-P之间显示出更高的保守性。另一方面，eIF-5A 的 C 末端的延伸与细菌 EF-P 的C 末端部分显示出序列相似性。由此可推测在进化过程中可能是 eIF5A 丢失了C-端的重复部分。基于对两种结构的了解，目前存在争论的主要是其进化的先后顺序，即尚不清楚最后一个共同的祖先是仅有两个结构域也就是类似于 eIF-5A的结构，随后在细菌谱系中通过重复获得了另外的结构域 III，还是是有三个结构域类似于细菌中的 EF-P，最后在进化过程中缩减为真核生物的两个结构域。

实验流程,克氏

嗜根考克氏菌 DC2201 翻译延伸因子 P 基因的克隆、表达及其单克隆抗体的制，制备的单克隆抗体可利用免疫亲和柱及免疫杂交的方式钓取天然蛋研究嗜根考克氏菌 DC2201 天然 EF-P 翻译后修饰方式奠定物质基础在细菌中的翻译后修饰方式的理论研究；其次，为探究 EF-P 翻译后考克氏菌 DC2201 的生物学意义奠定实验基础。研究内容及技术路线根据上述分析，本文的研究内容主要分为以下几方面：（1）嗜根考克氏菌 DC2201 EF-P 蛋白的生物信息学分析、表达及鉴（2）EF-P 重组蛋白诱导表达条件的优化；（3）制备抗 EF-P 重组蛋白的单克隆抗体。具体的实验研究路线如下图 1-2 所示：

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