黄瓜CsMPC1和CsE1α基因在线粒体介导植物PCD中的作用研究

发布时间：2020-07-07 11:21

【摘要】：水杨酸(SA)是植物防御的关键信号因子,可以诱导某些抗病基因的表达,在植物抗病中起重要作用。课题组前期研究证实,SA能够诱导黄瓜叶片发生超敏反应(HR),是一个细胞程序性死亡(PCD)的过程。为进一步探究SA的作用机制,对SA处理前后的黄瓜叶片进行了转录组分析,得到1756个差异表达基因。本研究选择与线粒体功能相关的显著上调表达的CsMPC1和CsE1α基因,研究其表达特性,利用超表达拟南芥和突变体拟南芥研究基因的功能,为揭示基因在线粒体介导的PCD中的作用奠定基础。研究结果如下:1.用10mM SA和0.2%MeJA分别处理黄瓜叶片,在营养器官根、茎、叶和MeJA处理叶片进行CsMPC1和CsE1α基因的qRT-PCR表达分析,并对根、茎、叶和SA和MeJA处理叶片进行相应指标丙酮酸(PA)含量和丙酮酸脱氢酶(PDH)活性测定。CsMPC1和CsE1α基因在叶片中具有较高表达量,在MeJA处理介导PCD过程皆呈上调表达调控;CsMPC1丙酮酸转运体基因水平改变引起其转运PA含量的变化,比较发现两者呈负相关;CsE1α丙酮酸脱氢酶基因水平的改变影响PDH活性的变化,比较发现两者呈正相关。但MeJA和SA处理发生PCD过程中PDH活性无明显变化。2.根据mRNA开放读码区序列设计引物,从黄瓜中克隆CsMPC1和CsE1α基因。CsMPC1基因cDNA全长311bp,蛋白由103个氨基酸构成。CsE1α基因cDNA全长1199bp,蛋白由399个氨基酸构成。通过NCBI BlastX比对测序结果显示CsMPC1属于MPC超家族,CsE1α属于TPP超家族。3.构建CsMPC1和CsE1α基因的超表达载体,通过农杆菌介导的浸花法将质粒转入到野生型拟南芥植株中,获得了转CsMPC1和CsE1α基因拟南芥植株。利用三引物法将从拟南芥生物资源中心获得MPC1基因(SALK_089763.42.10.x)和E1α基因(SALK_056967.56.00.x)T-DNA插入突变体进行PCR鉴定获得纯合株系。4.对筛选出的MPC1和E1α的超表达拟南芥植株(OE-1和OE#-1)和突变体拟南芥植株(mpc1-1和E1α-1)进行表型鉴定、生理指标测定和PCD鉴定。结果如下:(1)突变体植株mpc1-1对ABA敏感,具有抗旱的功能;超表达植株OE-1转运PA水平升高,表明PA转运体行使功能;突变体植株mpc1-1转运PA水平降低,表明PA转运受到阻碍,导致线粒体功能下降,糖酵解途径增强,植株生长受到抑制,但在超表达和突变体植株中均未检测到PCD现象。说明MPC1基因超表达与敲除时,PA代谢发生变化但并不影响植物PCD的发生,这是因为在MPC1基因敲除时MPC家族其他转运蛋白仍在行驶功能,MPC1基因超表达时植株正常生长没有出现细胞死亡现象。(2)超表达植株OE#-1正常生长,并且PDH活性与WT无明显差异,没有出现细胞死亡的现象;在突变体植株E1α-1中PDH活性受到抑制,生物体的有氧代谢受到阻碍,严重阻碍细胞的呼吸,导致ROS大量积累,可能引起植物PCD发生,从而影响植株正常生长发育。这说明E1α基因敲除可能引起植物PCD的发生。
【学位授予单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2;S642.2
【图文】：

茉莉酸甲酯,水杨酸,黄斑,叶片

2.3 结果与分析2.3.1 水杨酸、茉莉酸甲酯处理黄瓜叶片的形态变化如图 2-1 所示：SA 处理后 3h 叶片出现较明显黄斑，且仅在 SA 滴加处，没扩散到其它未施加 SA 的区域。叶片与处理前相比变薄；12h 后，叶片上的黄斑得越来越明显，数量增加，面积逐渐扩大。较处理前相比叶片边缘明显变薄且色变成黄色；随着处理时间的延长，叶片上黄斑愈发严重，24h 黄斑面积达到最较处理前相比叶片边缘明显变薄且颜色变成黄色。以上结果表明，在滴加 SA后 PCD 被激活，叶片上 SA 处理区域细胞死亡；且随时间推移病斑面积逐渐变扩散到未处理区域，在 24h PCD 程度达到最大化，大面积叶片细胞出现死亡现MeJA 处理黄瓜叶片 3h 后，未出现较明显黄斑；随处理时间延长，至 12MeJA 处理区域出现大量黄斑，且叶片边缘变得枯黄，叶片与处理前明显变得轻24h 病斑面积并未扩大，但叶片厚度明显变薄，叶片从边缘开始出现干枯现象。上结果表明，在滴加 MeJA12h 后 PCD 被明显激活，24h 后叶片细胞死亡程度达大化。

茉莉酸甲酯,黄瓜根,叶片,内参

图 2-2 黄瓜根、茎、叶（A）和茉莉酸甲酯（MeJA）（B）处理叶片的总 RNAA： 1：根； 2：茎； 3：叶；B： 1：MeJA 处理 0h； 2：MeJA 处理 3h；3：MeJA 处理 12h； 4：MeJA 处理 24hFig.2-2 Total RNA from the roots, stems and leaves of Cucumis sativus and the leaves ofCucumis sativus treated by MeJAA: 1：roots； 2：stems； 3：leaves；B: 1: MeJA treated leaves for 0h; 2:MeJA treated leaves for 3h;3: MeJA treated leaves for 12h; 4: MeJAtreated leaves for 24h2.3.3 CsMPC1 和 CsE1α基因的 RT-PCR 表达分析当内参基因的亮度一致时，利用半定量 RT-PCR 初步鉴定和分析目的基因表达水平[72]。如图 2-3-A 采用 RT-PCR，检测到黄瓜营养器官根、茎、叶中 CsMPC1 和CsE1α基因表达水平。CsMPC1 基因在根和叶中均表达，在茎中未明显表达，在叶中具有最高表达量；CsE1α基因在根、茎、叶三个组织中均有表达，但从琼脂糖凝胶电泳条带亮度分析，根茎叶中基因的表达量均低于内参基因 18s。其中，叶片中

黄瓜根,茉莉酸甲酯,茎叶,叶片

-3 黄瓜根茎叶（A）和茉莉酸甲酯（MeJA）（B）处理叶片半定量表达分g.2-3 The Semi-quantitative expression analysis of in the roots, stems and leaveof cucumber and leaves of Cucumis sativus treated by MeJAPC1 和 CsE1α基因的 qRT-PCR 表达分析量 RT-PCR 相比，实时荧光定量 PCR 更加灵敏，快速，重复性析表达水平更具权威性[73]。图 2-4 利用 qRT-PCR，检测黄瓜根、理叶片 CsMPC1 和 CsE1α基因表达水平。黄瓜根茎叶 CsMPC1 和，采用 2 CT法分析数据，根表达量设定为单位 1，并且 CsMP相对表达水平是根的两倍。茎中相对根部表达量低，是根部的，茎和叶的表达量均高于根部，分别约为根部的 2 倍和 8 倍。前期利用 10mM 水杨酸处理黄瓜叶片，CsMPC1 和 CsE1α基因。图 2-4 MeJA 处理下 CsMPC1 和 CsE1α基因也为上调表达调控，处理 3h 与对照 0h 相比上调幅度较小，至 12h 仍不明显，处理度升高，大约为 0h 的 8 倍，达到表达量高峰值；CsE1α基因 Me24h 持续稳定上升，12h 约为 0h 对照的 4 倍，24h 达到处理时间

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