表乳糖对双歧杆菌益生功效的影响及机制研究

发布时间：2020-07-12 00:51

【摘要】：表乳糖(Epilactose)是一种由D-半乳糖通过β-1,4糖苷键和D-甘露糖连接而成的稀有二糖,其与乳糖和乳果糖互为同分异构体。表乳糖能够促进大鼠肠道内双歧杆菌和乳杆菌的增殖,具有较好的益生元潜力。双歧杆菌(Bifidobacterium)是(母乳喂养)健康婴儿胃肠道中最早定殖且占主导地位的益生菌,具有抑制肠道病原菌、调节肠道菌群结构等诸多益生活性。产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)作为畜禽养殖动物肠道中的常见致病菌,可引起动物肠道疾病,导致食品安全问题,因而亟须对其进行有效控制。因此,本文将表乳糖这一稀有二糖用于双歧杆菌的增殖和产气荚膜梭菌的生物控制等研究领域中,旨在探究表乳糖对双歧杆菌的益生功效及益生机制,深入开发了表乳糖的益生潜力,对维护肠道健康控制肠道疾病等具有重要的现实意义。本文利用酶法转化乳糖制备表乳糖,在本室原有的制备工艺基础上,依据表乳糖与乳糖的溶解度特性,从反应体系中析出并移除了未反应的乳糖,大大简化了实验室制备高纯度表乳糖的步骤,并为后续研究提供了足量的表乳糖样品。本文分别在以表乳糖及其同分异构体乳糖或乳果糖为碳源的培养基中,培养了8种双歧杆菌,并对其增殖状况进行了评价。还将长双歧杆菌和产气荚膜梭菌置于以表乳糖、乳糖或乳果糖为碳源的培养基中进行共培养,通过菌落计数的方式测定两菌的生长状况,并且,通过牛津杯法测定了长双歧杆菌分别在表乳糖、乳糖和乳果糖培养基中的培养上清液对9种致病菌的抑菌活性,以探讨表乳糖和长双歧杆菌的联合抑菌效果。本文还分析了短双歧杆菌在表乳糖、半乳糖和甘露糖培养基中的转录组数据,以阐明表乳糖在短双歧杆菌中的代谢途径及益生机制。结果表明,使用优化后的表乳糖制备工艺,最终获得了纯度≥98%的表乳糖作为后续实验原料。8种双歧杆菌的培养结果表明,4株来源于人体肠道的长双歧杆菌、婴儿双岐杆菌、短双岐杆菌、青春双岐杆菌均可有效利用表乳糖进行增殖。在以表乳糖及其同分异构体为碳源的共培养体系中,产气荚膜梭菌的生长明显受到了长双歧杆菌的抑制,并且表乳糖在提高长双歧杆菌的存活率方面具有显著作用。牛津杯法测定表明,抑菌作用与长双歧杆菌培养上清液中的抑菌物质有关。短双岐杆菌转录组数据分析结果表明,短双歧杆菌表达了3种可水解β-1,4糖苷键的同工酶,表达了4个主要参与表乳糖转运过程的转运蛋白,推测表乳糖通过转运系统进入菌体后,可被水解成半乳糖和甘露糖为菌体提供能量,此外,表乳糖还对短双歧杆菌的乳酸、嘌呤核苷酸、氨基酸、叶酸以及肽聚糖等生物合成途径,以及代谢产物的跨膜运输过程具有促进作用。本文不仅评价了表乳糖对于增殖双歧杆菌和抑制病原菌的益生功效,还从双歧杆菌代谢途径上的基因表达角度,揭示了表乳糖体现其益生功效的内在机制。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.3
【图文】：

乳糖,分子结构式

乳糖(Lactose，4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖)和乳果糖(Lactulose，4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)互为同分异构体。图1.1 表乳糖分子结构式Fig. 1.1 The structure of epilactose1.1.1 表乳糖的制备表乳糖最早是由 Bergman 等在 1923 年化学合成乳糖时发现的一个中间产物(Schlenk et al.,1928)，因其多羟基结构使得化学合成制备表乳糖的路径较繁琐，通常需要经过 7 步反应才能完成(Haskins et al., 2002)。Tyler 等在 1967 年发现，白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus 7)能够将纤维二糖还原端的葡萄糖 C-2 位的羟基异构化，生成葡甘露二糖(4-O-β-D-glucopyranosy-1-D-mannose)(Tyler et al., 1967)，但他们并没有尝试将该酶用于制备表乳糖。直到 2008 年，Ito 等利用大肠杆菌异源表达纤维二糖差向异构酶基因，并利用该酶成功将乳糖转化为表乳糖(Ito et al., 2008)，自此以后

乳糖,异构化,图谱,确定图

12图 2.1 乳糖异构化 TLC 检LC detection of isomerizatio品；2：表乳糖标品；3： 2.2 C 所示。图谱显示考标准品图谱 2.2A 及确定图 2.2 C 中峰 1 为成率为 14.93%(w/w)。

乳糖,异构化,标准品,HPLC检测

2.4.2.1 乳糖结晶将酶法制备后的反应产物浓缩至原体积的60%(v/v)，置于4℃使乳糖结晶，离心去除结晶后，将剩余上清液通过HPLC检测，结果如图2.3 C所示，峰1为表乳糖，峰2为乳糖。与图2.2 C的异构化产物相比，去除结晶后，反应溶液中乳糖的相对比例下降，表乳糖的相对比例上升，表明反应溶液中的大部分乳糖得到了有效移除。通过面积归一化法分别计算去除结晶后的溶液中表乳糖及21

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