甲酸脱氢酶对氢气代谢影响及甲基绿降解的研究

发布时间：2020-07-12 21:29

【摘要】：三苯甲烷类染料广泛用于化工、着色等行业,产生大量工业废水,严重危害环境与人体健康。利用微生物降解染料是染料废水脱色的一种重要方法。Shewanella oneidensis MR-1是一株具有很强还原能力的革兰氏阴性菌,能够还原多种金属离子、二甲亚砜、延胡索酸、二甲基三甲胺等物质。本文以甲基绿为例,且在以丙酮酸为电子供体的自然条件下探索其电子传递途径,由于希瓦氏菌中从底物氧化至氢酶的电子传递途径尚不清晰,因此首先研究了希瓦氏菌在缺乏电子受体时合成氢气的电子传递路径。得出以下研究成果:(1)S.oneidensis MR-1具有三个完整的甲酸脱氢基因fdhA1B1C1,fdhA2B2C2和fdnGHI,且编码的蛋白质位于周质空间,这些甲酸脱氢酶在氢气代谢中的作用并非一致,通过构建甲酸脱氢酶单敲、双敲、三敲以及回补菌株突变株,将其与野生型细菌置于同一培养条件下,发现在甲酸驱动条件下,fdhA1B1C1与fdhA2B2C2均具有活性,而fdnGHI的作用并不明显。然而,当细胞中fdhA1B1C1与fdhA2B2C2基因缺失时,fdnGHI的转录水平显著上升,且该基因参与氢气合成。(2)当S.oneidensis MR-1以甲酸作为电子供体进行氢气代谢时,甲基萘醌参与细胞中的电子传递,这一结论也暗示了在S.oneidensis MR-1细胞中不存在甲酸-氢裂解酶(FHL,直接利用甲酸产生氢气)。(3)S.oneidensis MR-1氢酶(HydAB)基因簇中存在一个编码甲酸脱氢酶亚基的基因hydC,实验结果表明该基因的功能是承接醌池与氢酶(HydA)之间的电子传递。与此同时,利用Salinivibrio kushneri DD-1在不同培养条件下进行甲基绿脱色反应,并分析甲基绿降解产物,建立甲基绿降解的分析方法,为后续实验提供参考。
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X703;X172
【图文】：

Ｆｉｇ．４．１．邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｏｆｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ邋ｍｕｔａｎｔ邋ｗｉｔｈ邋１０邋ｍＭ邋ｆｕｍａｒａｔｅ逡逑４．２．２希瓦氏菌氢气代谢与醌池的联系逡逑在细菌生长即将进入稳定期时开始测定厌氧瓶中的氢气浓度，图４．２Ａ的结逡逑果显示野生型细菌仍能产生氢气，而在醌池突变株的厌氧瓶顶空并未检测到氢气逡逑的存在。同时将细菌浓度增大到ＯＤ＿＝０．５，在ｒｅｓｔｉｎｇ－ｃｅｌｌ条件下使细菌直接进逡逑行厌氧产氢气的活动（图４．２Ｂ），醌池突变株依然不能进行厌氧氢气代谢，这两逡逑种条进行下的结果共同证明了甲基萘醌时调控电子从甲酸转移至氢气中的媒介逡逑物质。逡逑为了更进一步证明这一结论，同时还构建了甲基萘醌的回补质粒，将其导入逡逑甲基萘醌的突变株中，其结果如图４．２Ｃ，回补菌株的生长及合成氢气的能力又逡逑恢复到野生型的水平，而导入了不含甲基萘醌的空质粒的突变株，仍然无法生长逡逑和进行氢气代谢。这些结果都暗示了希瓦氏菌细胞内产生的甲基萘醌类物质能够逡逑调节厌氧氢气代谢的电子传递。逡逑３７逡逑

０逦２０逦４０逦６０逦８０逦１００逦１２０逡逑Ｔｉｍｅ（ｈ）逡逑图４．１醌池突变株的生长动力学测定逡逑Ｆｉｇ．４．１．邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｏｆｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ邋ｍｕｔａｎｔ邋ｗｉｔｈ邋１０邋ｍＭ邋ｆｕｍａｒａｔｅ逡逑４．２．２希瓦氏菌氢气代谢与醌池的联系逡逑在细菌生长即将进入稳定期时开始测定厌氧瓶中的氢气浓度，图４．２Ａ的结逡逑果显示野生型细菌仍能产生氢气，而在醌池突变株的厌氧瓶顶空并未检测到氢气逡逑的存在。同时将细菌浓度增大到ＯＤ＿＝０．５，在ｒｅｓｔｉｎｇ－ｃｅｌｌ条件下使细菌直接进逡逑行厌氧产氢气的活动（图４．２Ｂ），醌池突变株依然不能进行厌氧氢气代谢，这两逡逑种条进行下的结果共同证明了甲基萘醌时调控电子从甲酸转移至氢气中的媒介逡逑物质。逡逑为了更进一步证明这一结论，同时还构建了甲基萘醌的回补质粒，将其导入逡逑甲基萘醌的突变株中，其结果如图４．２Ｃ，回补菌株的生长及合成氢气的能力又逡逑恢复到野生型的水平，而导入了不含甲基萘醌的空质粒的突变株，仍然无法生长逡逑和进行氢气代谢。这些结果都暗示了希瓦氏菌细胞内产生的甲基萘醌类物质能够逡逑调节厌氧氢气代谢的电子传递。

图４．３甲酸氧化驱动下的氢气合成电子传递途径逡逑Ｆｉｇ．４．３．邋Ｐｒｏｐｏｓｅｄ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｄｒｉｖｅｎ邋ｂｙ邋ｆｏｒｍａｔｅ邋ｏｘｉｄａｔｉｏｎ逡逑

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本文编号：2752511