基于局域DNA级联反应的高灵敏蛋白质检测
发布时间：2020-07-16 23:07
【摘要】：目的:结合邻位诱导杂交技术,DNA纳米结构和局域空间内DNA级联反应,发展一个操作简单、快速,灵敏度高,特异性好且能够在复杂样品中使用的通用型蛋白质检测方法,为生物分子检测提供新的思路。方法:通过酶连接反应合成环形DNA模板,利用滚环扩增反应制备得到长链结构的DNA纳米支架。将一对发夹结构的DNA链(H1和H2)与纳米支架通过自组装,合成可响应的DNA纳米灯,将其作为信号探针。以两个核酸适配体作为邻位杂交探针,当有目标蛋白质存在时,一对邻位探针同时识别目标分子,使探针两端连接的DNA链相互邻近并杂交,形成单链DNA。该DNA单链可以通过指点取代反应将发夹H1打开,诱导H1和H2之间发生级联杂交反应,产生荧光信号。通过血清稳定性实验,验证了DNA纳米灯的稳定性;通过动力学实验,与均相DNA级联反应的反应速度和效率进行了比较;通过检测产生的荧光信号,实现对目标蛋白质的定量。利用三种非目标蛋白质作为模型,验证了该分析方法的特异性;通过对血液样品的检测,验证了该分析方法的准确性。结果:研究结果表明,与发夹探针相比,信号探针DNA纳米灯有更好血清稳定性。利用凝血酶作为目标蛋白质模型,本论文发展的检测方法,能够在温育30 min后实现对目标物的检测。与均相DNA级联反应相比,邻位诱导局域空间内DNA级联反应效率更高、速度更快,且有很好的灵敏度,线性范围为0.1 nM-20 nM,检测限为0.091 nM。同时,添加回收率范围是97.1%-103.0%,RSD范围是2.28%-6.78%。说明该方法能够有很好的重复性和选择性。实际血清样品检测相对偏差小于6.5%。说明该分析方法有很好的实用性和准确性。结论:本文发展了一个选择性好,灵敏度高的蛋白质检测方法,该方法操作简单,无需分离,可以在溶液中一步完成,并能够用于复杂生物样品检测。通过改变邻位探针上的识别分子,该方法可以用于其它目标蛋白质检测,有很好的通用性,在生物分析和临床检测中有良好的应用前景。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q503
【图文】：
NA 纳米灯作为信号探针，当有目标蛋白质存在时，一对 DNA 适配体亲和探针2）特异性的结合同一目标蛋白质，导致亲和性探针邻位杂交，形成一条单链 D链 DNA 可以与 DNA 纳米灯上发夹 H1 的指点反应，将发夹 H1 打开，并将环来。释放的环部序列可以作为被激活的指点，与发夹 H2 杂交，将其打开。同 H2 的环部被释放出来，可以与下一个 H1 杂交。如此类推，一个目标蛋白质 DNA 纳米灯上多个 H1 和 H2 发生级联杂交反应，产生荧光信号，从而达到信效果。与以前报道的无酶催化放大技术[55-57]以及邻位杂交信号放大方法[58,59]相 纳米灯将多个发夹限制在一个局域的空间内，不仅提高了反应速度和反应效加了检测的灵敏度。该蛋白质检测方法操作简单、快速，有很好的灵敏度和选择凝血酶分子作为检测模型，该方法检测限达到 pM 水平。此外，该方法有很好，通过改换探针上相应的识别分子，该方法可以用于多种目标蛋白质检测。该简单，稳定性好，能够用于复杂生物样品检测，在临床检测和生物分析中有很前景。
第二章 实验结果及分析NA 纳米灯（DNL）表征先通过凝胶电泳对 DNA 纳米灯的制备进行了表征（图 2-1A）。在滚环扩一条碱基数在 500-2500 之间的拖尾的 DNA 带(条带 2)，说明制备得到长架。将物质的量相等的 DNA 纳米支架与发夹 H1(条带 3)和 H2(条带 4)混合纯化后，从图中可以看出，生成一个分子量更大的拖尾的条带 5，且反应消失，说明 H1，H2 结合在 DNA 纳米支架上，成功制备得到 DNA 纳米灯利用原子力显微镜进一步对 DNA 纳米灯进行了表征。从图 2-1B 可知，样纳米结构生成，直径约为 360 ±200 nm，高度约为 2.5 nm，说明双链状因为 H1 和 H2 各与 DNA 纳米支架有 24 个碱基互补配对，约为 8.16 nM DNA 纳米灯大约含有 22 对发夹 H1/H2。
东南大学硕士学位论文13图2-2. (a) 发夹Cy5-H1标准曲线；(b) 双色DNA纳米灯在激发波长为649 nm 时的荧光扫描波谱；(c) 发夹Cy3-H2标准曲线；(d) 双色DNA纳米灯在激发波长为514 nm 时的荧光扫描波谱。数据误差棒表示平均值± 标准偏差 (n=3).值约为1:1。由于进行级联反应时，H1和H2以1:1进行，因此，DNA纳米灯上H1和H2等量组装为其级联反应能够顺利进行提供了基础。2.2 DNA 纳米灯（DNL）稳定性分析图2-3. DNA纳米灯特稳定性表征. (a) DNA纳米灯热稳定性曲线. (b) 热稳定性曲线负一阶导数。
本文编号：2758630
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q503
【图文】：
NA 纳米灯作为信号探针，当有目标蛋白质存在时，一对 DNA 适配体亲和探针2）特异性的结合同一目标蛋白质，导致亲和性探针邻位杂交，形成一条单链 D链 DNA 可以与 DNA 纳米灯上发夹 H1 的指点反应，将发夹 H1 打开，并将环来。释放的环部序列可以作为被激活的指点，与发夹 H2 杂交，将其打开。同 H2 的环部被释放出来，可以与下一个 H1 杂交。如此类推，一个目标蛋白质 DNA 纳米灯上多个 H1 和 H2 发生级联杂交反应，产生荧光信号，从而达到信效果。与以前报道的无酶催化放大技术[55-57]以及邻位杂交信号放大方法[58,59]相 纳米灯将多个发夹限制在一个局域的空间内，不仅提高了反应速度和反应效加了检测的灵敏度。该蛋白质检测方法操作简单、快速，有很好的灵敏度和选择凝血酶分子作为检测模型，该方法检测限达到 pM 水平。此外，该方法有很好，通过改换探针上相应的识别分子，该方法可以用于多种目标蛋白质检测。该简单，稳定性好，能够用于复杂生物样品检测，在临床检测和生物分析中有很前景。
第二章 实验结果及分析NA 纳米灯（DNL）表征先通过凝胶电泳对 DNA 纳米灯的制备进行了表征（图 2-1A）。在滚环扩一条碱基数在 500-2500 之间的拖尾的 DNA 带(条带 2)，说明制备得到长架。将物质的量相等的 DNA 纳米支架与发夹 H1(条带 3)和 H2(条带 4)混合纯化后，从图中可以看出，生成一个分子量更大的拖尾的条带 5，且反应消失，说明 H1，H2 结合在 DNA 纳米支架上，成功制备得到 DNA 纳米灯利用原子力显微镜进一步对 DNA 纳米灯进行了表征。从图 2-1B 可知，样纳米结构生成，直径约为 360 ±200 nm，高度约为 2.5 nm，说明双链状因为 H1 和 H2 各与 DNA 纳米支架有 24 个碱基互补配对，约为 8.16 nM DNA 纳米灯大约含有 22 对发夹 H1/H2。
东南大学硕士学位论文13图2-2. (a) 发夹Cy5-H1标准曲线；(b) 双色DNA纳米灯在激发波长为649 nm 时的荧光扫描波谱；(c) 发夹Cy3-H2标准曲线；(d) 双色DNA纳米灯在激发波长为514 nm 时的荧光扫描波谱。数据误差棒表示平均值± 标准偏差 (n=3).值约为1:1。由于进行级联反应时，H1和H2以1:1进行，因此，DNA纳米灯上H1和H2等量组装为其级联反应能够顺利进行提供了基础。2.2 DNA 纳米灯（DNL）稳定性分析图2-3. DNA纳米灯特稳定性表征. (a) DNA纳米灯热稳定性曲线. (b) 热稳定性曲线负一阶导数。
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 曾颖;蔡玮红;;食品过敏原快速检测技术方法研究进展[J];包装与食品机械;2015年03期
2 李晶;滕霞;刘传银;;电化学生物传感器测定甲胎蛋白的研究进展[J];化学研究与应用;2015年01期
3 林影;叶茂;韩双艳;吴晓英;;免疫检测技术的研究进展[J];食品与生物技术学报;2007年04期
本文编号：2758630
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2758630.html
